一种多肽固相合成法制造技术

本发明专利技术涉及一种多肽固相合成法，尤其涉及一种利用数字化模式确定工艺条件的固相合成多肽的方法。本发明专利技术的多肽固相合成法可提升产物收率，并降低了副反应发生率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种多肽固相合成法，尤其涉及一种利用数字化模式确定工 艺条件的固相合成多肽的方法。
技术介绍
目前多肽的合成工艺主要有两种，分别为液相合成法和固相合成法，多肽液相合成基于将单个N-a保护氨基酸反复加到生长的氨基成份上。多肽固 相合成一般以树脂为起始原料，逐个连接氨基酸得到多肽粗品，为了防止副 反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是被保护的。而反应物的羧基端是 游离的，并且在反应之前必须活化。现阶段本领域多采用固相合成法，其优 点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个 反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得 高产率的产物，同时产物很容易分离。在多肽固相合成中，氨基酸的极性以及空间位阻和縮合位置都会对多肽 的合成难易程度造成影响。 一般情况下，在縮合位置相同的条件下，氨基酸 极性越大，縮合难度越小，空间位阻越大，縮合难度越大；氨基酸极性越小， 縮合难度越大，空间位阻越小，縮合难度越小。同一个氨基酸縮合位置越靠 后，縮合难度越大；縮合位置越靠前，縮合难度越小。因此在多肽合成过程 中，要充分综合考虑氨基酸的极性以及空间位阻和縮合位置。在縮合反应过 程中，反应时间和反应温度决定着最终产物的纯度和收率。反应时间过长， 氨基酸链会从固相树脂中脱落，导致收率降低。反应时间过短，又不能达到 反应终点，导致最终产物纯度降低。反应温度过低，也会造成反应到不了终 点，反应温度过高，很易发生消旋副反应。虽然目前多肽固相合成技术已采用全自动多肽合成仪来完成多肽固相合 成反应程序，但如何根据不同反应物质所具有的不同极性参数、空间位阻和 缩合位置来确定其合成反应过程中的反应时间和反应温度现已成为多肽固相 合成反应中的一个尚待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种多肽固相合成法，其縮合反应时间和温度可 依据多肽固相合成反应中待反应的氨基酸的极性参数、空间位阻和縮合位置 来确定。按照所得到的反应温度及时间利用全自动多肽合成仪进行多肽的合 成，可提升产物收率，并降低了副反应发生率。本专利技术提供的全自动多肽合成仪的縮合反应温度和縮合反应时间是如 下设定的首先，将由表一得到的待反应氨基酸的极性参数、空间位阻和縮合位置 参数代入公式d=a+b+0.017n中求得d值，式中a为极性参数，b为空间位阻， 0.017n为缩合位置参数，d为综合縮合参数<table>table see original document page 6</column></row><table><table>table see original document page 7</column></row><table>脯氨酸的縮合时间为180-240分钟，縮合温度为30-35°C。本专利技术所提供的多肽固相合成法，采用了数字化模式，将反应物的极性 以及空间位阻标示成参数，根据多次实验总结的经验公式c^a+b+0.017n，计 算出反应物的综合縮合参数d;再根据多次试验经验总结出的表二，得到反 应所需的反应温度和反应时间。按照所得到的反应温度及时间利用全自动多 肽合成仪进行多肽的合成，提升了产物收率，降低了副反应发生率。利用数字化模式进行固相合成得到的多肽，经过常规方法的分离、纯化，收率与常规方法相比提升10%以上，产品起始纯度提高5%。 附图说明图1示出本专利技术的多肽固相合成法所合成的生长抑素的HPLC数据； 图2示出常规多肽固相合成法所合成的生长抑素的HPLC数据。具体实施例方式下面将通过具体实施例对本专利技术进行详细描述。应当理解，这里描述的 实施例只用于举例说明，并不用于限制本专利技术。实施例l、生长抑素的固相合成法 本专利技术所述的固相合成法 实施例Al将树脂装入全自动多肽合成仪的肽反应瓶中，将第一个经过羧基活化的 氨基酸溶液加入全自动多肽合成仪的肽反应瓶中，根据下述表一计算综合縮 合参数d，根据综合縮合参数d对照下述表二在控制程序中输入相应的反应 温度和反应时间，进行縮合。按以上方法依次进行后面氨基酸的縮合，直到 最后一个第14位氨基酸的縮合结束，得到带全保护基的树脂，洗涤全侧链保 护的肽树脂后取出，自然干燥。加入切肽试剂进行切肽后进行减压浓縮、洗 涤，通入纯氧，氧化后浓縮、过滤、纯化。<table>table see original document page 8</column></row><table><table>table see original document page 9</column></row><table>具体操作为 配料(1)称取H-Cys(Trt)-2-C1-Trt-Resin树脂20g装于全自动固相合成仪(美国 SCBio公司，型号CS936S)的反应瓶中，加入二甲基甲酰胺(DMF)适量， 溶胀2小时。(2) 氨基酸縮合液的配制称取Fmoc-Ser (tBu) -OH11.50g， Fmoc-Thr(tBu)-OH U.93g， Fmoc陽Phe陽OH 11.63g， Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.93g， Fmoc-Lys(Boc)-OH 14.06g， Fmoc-Trp-OH 12.80g， Fmoc匿Phe陽OH 11.63g， Fmoc-Phe-OH 11.63g， Fmoc-Asn (Trt)-OH 17.90g， Fmoc-Lys(Boc)-OH 14.06g， Fmoc—Cys(Trt)-OH 17.58g， Fmoc—GIy-OH 8.93g， Fmoc-Ala-OH 9.34g并分别 装入于13个三角瓶中，再向每个三角瓶中分别加入二环己基碳二亚胺(DCC) 和DMF溶解，滤去沉淀，将滤液加入全自动合成仪储备瓶中，备用。(3) 配制30%哌啶DMF溶液、DMF (分析纯)、二氯甲烷(DCM)(分 析纯)，分别加入全自动合成仪原料储备瓶中。2、縮合在上述表一中查到所述各种氨基酸的极性参数，空间位阻及縮合位置， 计算出综合缩合参数d，再根据d在上述表二中査出相应的反应温度和时间。 所述各种氨基酸(按顺序)参数d及相应的反应温度及时间详见下表三表三各种氨基酸参数d及相应的反应温度及时间表<table>table see original document page 10</column></row><table>将表三中计算好的数据输入全自动化固相合成仪的控制系统的SOM(生 长抑素)2号程序中，运行SOM2号程序脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc-)，縮 合完后用配制好的DMF和DCM洗涤6次，当縮合进行到距理论反应结束时 间还差十分钟时，用茚三酮乙醇溶液检测是否达到反应终点。若反应达到终点时，用30%哌啶DMF溶液洗涤1次，再用DMF洗涤3次。重复以上縮合 步骤进入下一个氨基酸的縮合程序。直到所述13个氨基酸均缩合完毕，关闭 固相合成仪。3、 切肽所述14个氨基酸反应縮合完毕后，80%的三氟乙酸(TFA)水本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽固相合成方法，其特征在于，利用多肽合成仪进行多肽合成时，其缩合反应温度和缩合反应时间是如下设定的：　首先，将由表一得到的待反应氨基酸的极性参数、空间位阻和缩合位置参数代入公式ｄ＝ａ＋ｂ＋０．０１７ｎ中求得ｄ值，式中ａ为极性参数 ，ｂ为空间位阻，０．０１７ｎ为缩合位置参数，ｄ为综合缩合参数：　表一　＊＊＊　然后，根据所得的综合缩合参数ｄ，由表二得到相应缩合反应的缩合反应时间及缩合反应温度：　表二　＊＊＊。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赖涛，冯朴纯，
申请(专利权)人：昆明积大制药有限公司，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]