多肽微波固相合成法制造技术

多肽微波固相合成法涉及的是一种微波辅助下的多肽固相合成方法。多肽微波固相合成法为：（１）氨基酸－树脂复合物的制备：加入二氯甲烷溶胀多肽合成树脂；在羧基端氨基酸和缩合试剂中加入溶剂，反应结束后过滤，将滤液加入树脂中，同时加入二甲氨基吡啶反应。（２）微波辐射脱除氨基保护基：在氨基酸－树脂复合物中加入脱保护试剂，微波辐射下反应。（３）微波辐射缩合氨基酸：溶解下一个氨基酸和缩合试剂，加入到氨基酸－树脂复合物中，微波辐射下反应。（４）更换氨基酸，重复（２）和（３）合成所需的多肽。（５）多肽粗品的制备：在合成的肽链中加入切割试剂，微波辐射。反应结束后过滤，旋转蒸发滤液，向余液中加入冰乙醚，析出多肽粗品。

【技术实现步骤摘要】

多肽微波固相合成法涉及的是一种微波辅助下的多肽固相合成方法，本专利技术属有机化学和药物化学领域。
技术介绍
一般来讲，多肽指由低于五十个氨基酸组成的化合物，它具有多种多样的生物活性。人们发现存在于生物体的多肽有数万种，并且发现所有的细胞都能合成多肽。同时，几乎所有细胞也都受多肽调节，它涉及激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域。它们是沟通细胞间与器官间信息的重要化学信使，通过内分泌、神经内分泌乃至神经分泌等作用方式行使其微妙的信息传递功能，从而使有机体组合成一系列高度严密的控制系统，调节生长、发育、繁殖、代谢和行为等生命过程，对于发育和新陈代谢的过程有着包括复杂调节和直接作用的多重生物功能。多肽化学合成法可分为液相合成和固相合成法。液相合成法的反应在液相中进行，由于每一步反应后都需要将中间产物分离纯化出来，因此工艺过于繁杂，操作实施比较困难。固相合成法采用不溶性载体键合的聚合物，只要简单的反复过滤和洗涤，即可将可溶性的试剂和副产物分离出来。工艺简单，是化学合成多肽的首选方法。目前，固相多肽合成中存在的主要问题一是由于固液之间的传质问题而使得反应速度较慢，每个氨基酸的连接时间在两个小时或以上，肽制备工艺时间长；二是由于氨基酸过量倍数高而增加了肽合成成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述不足之处，提供一种多肽微波固相合成法，在微波辅助下的固相多肽合成方法和传统方法相比，大大缩短了反应时间，减少了氨基酸的过量倍数，提高了产物的纯度，最终降低了多肽的生产成本。微波指波长1μm～1mm，频率从300MHz～300GHz的超高频电磁波。微波已被广泛应用于各学科领域。微波在化学中的应用开辟了微波化学这一化学新领域，即微波直接与化学体系发生作用，从而促进各类化学反应的进行。微波的作用原理目前主要存在两种理论一是极性介质在微波场作用下随其高速旋转而产生相当于“分子搅动”的运动，从而被均匀地加热及混合，提高反应速率。二是微波对化学反应作用是非常复杂的，除了具有热效应外还存在一种不是由温度引起的非热效应，它能改变反应的动力学性质，降低反应的活化能，存在着某些特定的非热效应的影响。微波技术具有清洁、高效、耗能少、污染低等特点，已在无机化学、有机化学分析化学和环境化学等学科中已经得到了广泛的应用。多肽微波固相合成法是采取以下方案实现本专利技术使用能吸收微波的溶剂如二甲基甲酰胺(DMF)为介质，将微波技术应用在多肽合成中脱除氨基保护基、氨基酸缩合、多肽粗品的制备以及二硫键的形成四步反应中，利用微波的特殊效应，降低反应的活化能，提高反应速度。所用的微波频率为2450赫兹，温度和压力可以在线控制，以维持恒定温度为控制条件，微波的功率随之变化。多肽微波固相合成法为 氨基酸-树脂复合物的制备称量一份多肽合成树脂，可以是羟基树脂如王(wang)树脂、氯树脂如2-氯-三苯甲基氯树脂和氨基树脂如Rink Amide树脂中的一种，放入带过滤装置的反应器中，向其中加入二氯甲烷(DCM)，溶胀树脂30～120min，然后抽掉二氯甲烷溶液。称量羧基端氨基酸和缩合试剂——二环己基碳二亚胺(DCC)或二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-羟基苯丙三氮唑(HOBt)，放入可以密封的容器中，加入二甲基甲酰胺或四氢呋喃(THF)或N-甲基吡咯烷酮(NMP)，反应30～150min。所述的氨基酸是侧链官能团和氨基端均受到保护的保护氨基酸。所述的氨基酸和树脂物质的量的比为7～3∶1；氨基酸和缩合试剂物质的量的比为1∶1～1.2。反应结束后，过滤掉沉淀，将滤液加入到装有树脂的带过滤装置的反应器中，同时加入二甲氨基吡啶(DMAP)，反应4～20个小时。其中二甲氨基吡啶和树脂物质的量的比为0.1～0.5∶1。然后抽掉反应液，用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷依次洗涤树脂三次。微波辐射脱除氨基保护基在上面洗涤得到的氨基酸-树脂复合物中加入脱保护试剂——20～30％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液，然后将置于微波反应器中反应，微波条件是温度为20～70℃，反应时间为3～10min。反应完毕后，过滤抽掉溶液，用二甲基甲酰胺、甲醇(MeOH)、二氯甲烷洗涤树脂。微波辐射缩合氨基酸称量下一个保护氨基酸和缩合试剂，放入可以密闭的容器中，加入溶剂溶解。其中所述的缩合试剂包括二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并三氮唑(HOBt)，苯并三氮唑-N，N，N′，N′，-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAT)，卡特缩合剂BOP reagent，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)，二异丙基乙基胺(DIEA)，和它们的衍生物中的几种。所述的氨基酸和树脂物质的量的比为4～2∶1；氨基酸和缩合试剂物质的量的比为1∶1～1.2。所述的溶剂为二甲基甲酰胺、吡啶、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃。然后将溶液加入到装有脱除氨基保护基的氨基酸-树脂复合物的反应器中，置于微波反应器中反应，微波条件是温度为20～70℃，反应时间为3～10min。反应完毕后，抽掉反应液，用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷洗涤树脂。按照氨基酸从羧基端到氨基端的顺序，更换氨基酸，重复微波辐射脱保护和微波辐射缩合氨基酸的反应，合成所需的肽链。多肽粗品的制备将上面得到的保护肽链-树脂放入可以密闭的容器中，加入切割试剂，微波辐射下反应。所述的切割试剂包括三氟乙酸(TFA)、重蒸水、三乙基硅烷(TES)、三异丙基硅烷(TIS)、苯酚、苯甲硫醚、苯甲醚、乙二硫醇(EDT)和二氯甲烷。它们之间的组合和相互比例可以为①三氟乙酸∶三异丙基硅烷(或三乙基硅烷)∶重蒸水＝95％∶2.5％∶2.5％(v/v)；②三氟乙酸∶苯酚∶重蒸水∶苯甲醚∶苯甲硫醚＝80％∶5％∶5％∶2.5％∶2.5％(v/v)；③三氟乙酸∶苯酚∶重蒸水∶乙二硫醇∶苯甲硫醚＝80％∶5％∶5％∶2.5％∶2.5％(v/v)；④三氟乙酸∶重蒸水＝95％∶5％(v/v)；⑤三氟乙酸∶二氯甲烷＝50％∶50％(v/v)。微波条件为温度为30～60℃，反应时间为10～20min。然后过滤掉树脂，收集滤液，旋转蒸发除去三氟乙酸。向剩下的液体中加入冰乙醚，沉淀出多肽，然后离心，去除上清液，得到所需的多肽。对于含有二硫键的多肽，采用5～30％二甲亚砜(DMSO)/水溶液为氧化剂，在微波辐射下合成二硫键，微波条件是温度为20～60℃，反应时间为5～30min。所述的微波反应器由美国CEM公司制造，型号为Mars5。该微波反应器温度和压力可以在线控制，使得反应结果具有很好的重复性和可靠性。本专利技术和现有技术相比有如下特点1.大大提高反应的速率。常规固相多肽合成方法连接一个氨基酸一般需要时间两个小时或者更长的时间，而在微波辐射下，连接一个氨基的时间不超过10min，反应速率至少提高了11倍。因为微波辐射具有特殊的作用，可以降低反应的活化能，从而加快反应的进行。2.在微波辐射下进行二硫键的合成，缩短了反应的时间，提高了产物的纯度和产率。3.降低合成的成本。在常规方法中，氨基酸和缩合试剂与树脂的比例一般为5～3∶1，也即是氨基酸和缩合试剂的过量倍数为4～2倍，而氨基酸和缩合试剂占合成成本的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽微波固相合成法，其特征在于微波固相合成法为：（１）氨基酸－树脂复合物的制备：称量一份多肽合成树脂，放入带过滤装置的反应器中，向其中加入二氯甲烷，溶胀树脂３０～１２０ｍｉｎ，然后抽掉二氯甲烷溶液，称量羧基端氨基酸和缩合试剂－二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺和１－羟基苯丙三氮唑，放入可以密封的容器中，加入二甲基甲酰胺或四氢呋喃，反应３０～１５０ｍｉｎ，所述的氨基酸和树脂物质的量的比为７～３∶１；氨基酸和缩合试剂物质的量的比为１∶１～１．２，反应结束后，过滤掉沉淀，将滤液加入到装有树脂的带过滤装置的反应器中，同时加入二甲氨基吡啶，反应３～２０个小时，其中二甲氨基吡啶和树脂物质的量的比为０．５～０．１∶１，然后抽掉反应液，用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷依次洗涤树脂三次；（２）微波辐射脱除氨基保护基：在上面洗涤得到的氨基酸－树脂复合物中加入脱保护试剂－２０～３０％的哌啶／二甲基甲酰胺溶液，然后将置于微波反应器中反应，微波条件是：温度为２０～７０℃，反应时间为３～１０ｍｉｎ，反应完毕后，过滤抽掉溶液，用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷洗涤树脂；（３）微波辐射缩合氨基酸：称量下一个保护氨基酸和缩合试剂，放入可以密闭的容器中，加入溶剂溶解，所述的氨基酸和树脂物质的量的比为４～２∶１；氨基酸和缩合试剂物质的量的比为１∶１～１．２，所述的溶剂为：二甲基甲酰胺、吡啶、Ｎ－甲基吡咯烷酮、四氢呋喃，然后将溶液加入到装有脱除氨基保护基的氨基酸－树脂复合物的反应器中，置于微波反应器中反应，微波条件是：温度为２０～７０℃，反应时间为３～１０ｍｉｎ，反应完毕后，抽掉反应液，用二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷洗涤树脂；（４）按照氨基酸从羧基端到氨基端的顺序，更换氨基酸，重复微波辐射脱保护和微波辐射缩合氨基酸的反应，合成所需的多肽；（５）多肽粗品的制备：将上面得到的保护肽－树脂放入可以密闭的容器中，加入切割试剂，微波辐射下反应，微波条件为：温度３０～６０℃，反应时间为１０～２０ｍｉｎ，然后过滤掉树脂，收集滤液，旋转蒸发除去三氟乙酸，向剩下的液体中加入冰乙醚，沉淀出多肽，然后离心，去除上清液，得到所需的多肽粗品。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈树宝，王卫国，李佩华，应汉杰，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]