肿瘤抗原TRAG-3模拟表位肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了肿瘤抗原ＴＲＡＧ－３模拟表位肽及其应用，该模拟表位肽由Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ所示的氨基酸序列组成，其中，第５位Ａｓｐ为Ｄ－Ａｓｐ或者第６位Ａｌａ为Ｄ－Ａｌａ；与ＴＲＡＧ－３天然表位肽相比，本发明专利技术的模拟表位肽具有更好的抗酶降解稳定性，与ＨＬＡ－Ａ２．１具有更强的亲和力，并且对ＴＲＡＧ－３阳性肿瘤细胞表现出更强的ＣＴＬ特异性杀伤效应，可以用于制备治疗ＴＲＡＧ－３阳性肿瘤的多肽疫苗，在肿瘤免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种肿瘤抗原模拟表位肽，特别涉及肿瘤抗原TRAG-3模拟表 位肽，还涉及该模拟表位肽的应用。
技术介绍
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率疾病。其治疗方法主 要包括手术切除、放射治疗和化学药物治疗，但这些方法对某些肿瘤特别是晚 期恶性肿瘤的治疗效果还不尽如人意。近年来，肿瘤免疫治疗作为恶性肿瘤的 第四种治疗方法得到迅速发展。已有大量文献报道，基于肿瘤抗原细胞毒性T 淋巴细胞(CTL)表位的肿瘤疫苗在体内可有效诱导特异性杀瘤CTL的产生， 使部分患者的病情得到控制和緩解，而对正常组织无损害。因此，肿瘤疫苗的 研制具有重要意义和良好的应用前景。随着生物技术的发展，多种肿瘤抗原及其CTL表位被鉴定并成为肿瘤免疫 学及肺瘤疫苗发展的基础。其中，肿瘤睾丸抗原(CT)家族是一类包含多个基 因家族的肿瘤特异性共享抗原，广泛表达于多种实体瘤组织中，而在除睾丸、 胎盘外的其他正常组织不表达。因其在肿瘤组织表达的特异性和在体内激发细 胞免疫应答和体液免疫应答的有效性，CT抗原成为多种实体瘤特异性疫苗免疫 治疗的首选抗原。泰素耐药相关基因(TRAG-3 )编码的TRAG-3是由Duan等在寻找泰素耐 药基因时在泰素耐药的卵巢癌细胞抹SKOVTR中发现的一个新CT抗原，在多 种恶性肿瘤如非小细胞肺癌、软骨肉瘤和黑色素瘤中高表达，而在除睾丸组织 外的其他正常组织(肝脏、肺脏、肾脏、胰腺、骨骼肌、胎盘、心脏和脑)中 不表达。专利技术人在前期研究中发现，TRAG-358-66 (ILLRDAGLV)为HLA-A2.1限制性CTL表位，该表位肽负载树突状细胞肿瘤疫苗在体外能够有效激发抗瘤 CTL免疫反应。但是，天然表位肽存在不易被抗原递呈细胞摄取，易被肽酶降解等缺陷， 以其为基础构建的肿瘤多肽疫苗不能满足肿瘤免疫治疗的要求，必须对天然表 位肽进行改造，以增加CTL免疫应答强度和抗肽酶降解能力。近年来，运用非 天然氨基酸对生物活性肽进行化学修饰，研究其构效关系，进一步发展高效肽 类似物，已成为多肽化学研究的重要手段和方向之一。运用这种方法已得到许 多具有高活性、高选择性、半衰期长的肽类似物。因此，利用非天然氨基酸对 天然表位肽进行改造，有望获得既能激发较强CTL免疫应答，又能抗肽酶降解 的模拟表位肽。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于利用非天然氨基酸对TRAG-3天然表位 肽(TRAG-358-66, ILLRDAGLV)进行改造，获得既能激发较强CTL免疫应答， 又能抗肽酶降解的模拟表位肽；目的之二在于提供所得模拟表位肽的应用。为达到上述目的，在本专利技术的第一方面，提供了一种TRAG-3模拟表位肽， 由Ile-Leu-Leu-Arg-Asp-Ala-Gly-Leu-Val所示的氨基酸序列组成，其中，第5位 Asp为D-Asp或者第6位Ala为D-Ala。在本专利技术的第二方面，提供了所述TRAG-3模拟表位肽在制备治疗TRAG-3 阳性肿瘤的多肽疫苗中的应用。进一步，所述TRAG-3阳性肿瘤包括非小细胞肺癌、软骨肉瘤和黑色素瘤。本专利技术的有益效果在于研究结果显示，与TRAG-3天然表位肽相比，本 专利技术的TRAG-3模拟表位肽具有更好的抗酶降解稳定性，与HLA-A2.1具有更强 的亲和力，并且对TRAG-3阳性肿瘤细胞表现出更强的CTL特异性杀伤效应； 因此，本专利技术的模拟表位肽可以用于制备治疗TRAG-3阳性肿瘤的多肽疫苗， 在肿瘤免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作进一步的详细描述，其中图1为TRAG-3模拟表位肽T1的空间结构模拟图2为TRAG-3模拟表位肽Tl与HLA-A2.1的复合物的空间结构模拟图； 图3为TRAG-3模拟表位肽T2的空间结构模拟图4为TRAG-3模拟表位肽T2与HLA-A2.1的复合物的空间结构模拟图； 图5为TRAG-3模拟表位肽T1的质谱鉴定图； 图6为TRAG-3模拟表位肽T2的质谱鉴定图7为TRAG-3模拟表位肽Tl和T2与HLA-A2.1的亲和力4佥测结果图； 图8为TRAG-3模拟表位肽Tl和T2的抗酶解稳定性检测结果图； 图9为TRAG-3才莫拟表位肽Tl和T2对TRAG-3阳性肿瘤细胞的体外杀伤 能力才企测结果图10为TRAG-3模拟表位肽Tl和T2对TRAG-3阳性肿瘤细胞的体内杀伤 能力^r测结果图。具体实施例方式以下将参照附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中 未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第 三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。一、候选TRAG-3模拟表位肽的序列将TRAG-3天然表位肽(TRAG-358-66， ILLRDAGLV， SEQ ID No.l )中各个位置的丄-氨基酸分别单独用对应的D-氨基酸进行替换，获得9个候选TRAG-3模拟表位肽。二、候选TRAG-3模拟表位肽的分子动力学模拟1、 分子模型构建运用Silicon graphics工作站及Insight II软件包中的Discover 3.0才莫块(采用 CVFF力场)，对9个候选TRAG-3模拟表位肽与HLA-A2.1的复合物进行分子 动力学模拟。HLA-A2.1的初始坐标来自于蛋白质晶体结构数据库(ProteinData Bank)中流感病毒蛋白]\4158.66与HLA-A0201的复合物(登录号为1HHI),候 选TRAG-3模拟表位肽是运用Bioploymer模块对流感病毒Ml58-66进行氨基酸替 换而得。分子动力学^f莫拟分五步进行第一步，将HLA-A2.1与(32m固定，运 用最陡下降法对候选TRAG-3模拟表位进行2000步优化计算，然后用共轭梯度 法优化，直到能量均方根误差(RMS)小于0.1kal/moLA;第二步，在复合物周 围加一层7.5A的水分子，并固定复合物对水分子进行2000步能量优化，以消 除水分子之间以及水分子与蛋白质之间的不合理接触；第三步，对溶液状态下 的复合物进行能量最小化计算，非键相互作用采用9.5A的截断值，先后运用最 陡下降法和共轭梯度法优化，直到能量RMS小于0.1 kal/mol.A;第四步，在298K 的恒定温度下进行20皮秒的分子动力学计算；第五步，对动力学优化得到的最 后构象进行分子力学优化5000步，即得候选TRAG-3模拟表位肽与HLA-A2.1 的复合物的最终构象。2、 结合特征参数计算借助Homology模块，计算候选TRAG-3模拟表位肽中各残基的溶剂可及表 面积、锚定残基间距及氲键数等结合特征参数。溶剂可及表面积的计算采用Lee 和Richards定义的空间填充模型，选择水分子作为探针分子，溶剂半径选为 0.14nm。各残基尤其是锚定残基的溶剂可及表面积越小，说明模拟表位肽与 HLA-A2.1的嵌合越紧密。结果9个候选TRAG-3模拟表位肽中有2个(Tl和T2 )能够与HLA-A2.1紧密结合，Tl和T2的空间结构模拟图及其与HLA-A2.1的复合物的空间结构模 拟图见图1~4; Tl和T2与HLA-A2.1的结合特本文档来自技高网...

【技术保护点】
肿瘤抗原ＴＲＡＧ－３模拟表位肽，其特征在于：由Ｉｌｅ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ａｓｐ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ所示的氨基酸序列组成，其中，第５位Ａｓｐ为Ｄ－Ａｓｐ或者第６位Ａｌａ为Ｄ－Ａｌａ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱波，林治华，王槐亮，龙海霞，程晓明，陈正堂，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]