启动子、产苏氨酸重组微生物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物工程技术领域，具体涉及启动子、产苏氨酸重组微生物及其应用。本发明专利技术提供一种启动子，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明专利技术通过对dapA基因启动子进行理性设计，获得一个转录活性明显降低的突变的dapA基因启动子，该启动子可用于微生物基因的弱化表达。利用该启动子替换谷氨酸棒杆菌中dapA基因、ddh基因、ilvA基因、tdcB基因和gltA基因的原始启动子，使得这些基因的表达水平明显降低，由此构建的重组微生物中碳代谢流更多地流向苏氨酸合成代谢途径，菌株生产苏氨酸的能力得到显著提高，苏氨酸的产量较出发菌株显著提高，同时具有较好的生长性能。同时具有较好的生长性能。

【技术实现步骤摘要】
启动子、产苏氨酸重组微生物及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物工程
，具体涉及启动子、产苏氨酸重组微生物及其应用。

技术介绍

[0002]L
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苏氨酸(L
‑
Threonin)，化学名称为β
‑
羟基
‑
α
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氨基丁酸，分子式为C4H9NO3，相对分子质量为119.12。L
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苏氨酸是一种必需氨基酸，苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。
[0003]谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需要五步催化反应，这五步反应涉及的催化酶分别为天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB编码)以及苏氨酸合酶(thrC编码)。针对lysC基因和hom基因，目前已有抗反馈抑制的hom基因和lysC基因的报道(Reinscheid D J,Eikmanns B J,Sahm H.Analysis of a Corynebacterium glutamicum hom gene coding for a feedback
‑
resistant homoserine dehydrogenase.[J].Journal of Bacteriology,1991,173(10):3228
‑
3230；Eikmanns B J,Eggeling L,Sahm H.Molecular aspects of lysine,threonine,and isoleucine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum.[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1993,64(2):145
‑
163.)。目前已有一些利用谷氨酸棒杆菌发酵生产苏氨酸的工程菌构建的报道，例如：Lothar Eggling等通过弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glyA，同时过表达苏氨酸外运蛋白ThrE，使得苏氨酸的产量由49mM提高到67mM(Simic P,Willuhn J,Sahm H,et al.Identification of glyA(Encoding Serine Hydroxymethyltransferase)and Its Use Together with the Exporter ThrE To Increase L
‑
Threonine Accumulation by Corynebacterium glutamicum[J].Applied and Environmental Microbiology,2002,68(7):3321
‑
3327.)。
[0004]目前利用谷氨酸棒状杆菌生产苏氨酸的报道主要集中在苏氨酸的合成路径的代谢工程改造，而关于碳代谢流优化的报道较少。此外，在谷氨酸棒状杆菌中进行基因表达调控时，基因强化表达主要采用人工合成的强启动子、内源基因的强启动子或引入异源强启动子；而对基因进行弱化表达的启动子的报道则相对较少，基因的弱化主要依赖起始密码子的替换以及基因敲除技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种突变的dapA基因启动子。本专利技术的另一目的是提供利用该启动子进行基因表达调控构建的重组微生物及其应用。
[0006]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供一种启动子，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0008]以上所述的启动子为突变的dapA基因(4
‑
羟基
‑
四氢吡啶二羧酸合酶基因)启动子(mPdapA)，该突变启动子具有启动基因转录的活性，但是，与dapA基因野生型启动子相比，
该启动子启动基因转录的活性明显降低。
[0009]优选地，上述突变的dapA基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]本专利技术还提供一种生物材料，其含有上述突变的dapA基因启动子；所述生物材料为重组DNA、载体或宿主细胞。
[0011]以上所述的重组DNA可为在所述启动子的下游可操作性地连接目的基因得到的重组DNA，或者为在所述启动子的下游可操作性地连接目的基因、上游或下游可操作性地连接其他转录调控元件、翻译调控元件得到的重组DNA，或者为在所述启动子的上游和/或下游可操作性地连接用于同源重组的同源臂片段得到的重组DNA。
[0012]以上所述的载体可为质粒载体、病毒载体或转座子。
[0013]以上所述的宿主细胞优选为微生物细胞。
[0014]所述微生物细胞优选为埃希氏菌属或棒状杆菌属细菌。其中，埃希氏菌属细菌优选为大肠杆菌(Escherichia coli)；棒状杆菌属细菌优选为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)、有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)或产氨棒杆菌(Corynebacterium aminogenes)。
[0015]本专利技术提供上述突变的dapA基因启动子在启动目的基因表达中的应用。
[0016]上述应用具体为：将目的基因与突变的dapA基因启动子可操作性地连接，得到重组DNA，将重组DNA导入宿主细胞中，表达目的基因。
[0017]上述突变的dapA基因启动子可用于驱动目标代谢产物的代谢相关基因的表达，尤其可用于降低目标代谢产物的竞争途径相关基因的表达，以提高目标代谢产物的积累。
[0018]本专利技术还提供上述突变的dapA基因启动子在提高微生物代谢产物的产量或转化率，或在构建微生物代谢产物的生产菌株中的应用。
[0019]优选地，所述代谢产物为苏氨酸或其衍生物。
[0020]在苏氨酸发酵生产过程中，赖氨酸和异亮氨酸是苏氨酸发酵生产的主要副产物，赖氨酸和异亮氨酸合成途径是苏氨酸合成途径的主要竞争途径。因此，需要对赖氨酸合成途径等副产物途径进行阻断或弱化，使碳代谢流更多地流向苏氨酸合成途径。然而，直接敲除赖氨酸合成基因dapA等基因会导致菌株生长速度急剧下降或造成细胞营养缺陷，不利于苏氨酸的发酵生产。本专利技术发现，利用上述突变的dapA基因启动子弱化赖氨酸和异亮氨酸合成基因，能够避免产生营养缺陷，在保证菌株正常生长的情况下，显著提高碳代谢流向苏氨酸合成途径的分配，增强菌株苏氨酸的合成能力，减少赖氨酸和异亮氨酸的积累。
[0021]基于上述发现，本专利技术提供一种重组微生物，所述重组微生物中，选自以下(1)～(4)中至少一个酶的编码基因由上述突变的dapA基因启动子驱动转录：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种启动子，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。2.一种生物材料，其特征在于，其含有权利要求1所述的启动子；所述生物材料为重组DNA、载体或宿主细胞。3.权利要求1所述的启动子在启动目的基因表达中的应用。4.权利要求1所述的启动子在提高微生物代谢产物的产量或转化率，或在构建微生物代谢产物的生产菌株中的应用。5.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中，选自以下(1)～(4)中的至少一个酶的编码基因由权利要求1所述的启动子驱动转录：(1)4
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羟基
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四氢吡啶二羧酸合酶；(2)二氨基庚二酸脱氢酶；(3)苏氨酸脱水酶；(4)柠檬酸合酶。6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中，天冬氨酸激酶和/或高丝氨酸脱氢酶的酶活性被增强和/或解除反馈抑制；优选地，所述酶活性的增强是由选自以下1)～6)，或任选的组合实现的：1)通过导入具有所述酶的编码基因的质粒而增强；2)通过增加染色体上所述酶的编码基因的拷贝数而增强；3)通过改变染色体上所述酶的编码基因的启动子序列而增强；4)通过将强启动子与所述酶的编码基因可操作地连接而增强；5)通过对酶的氨基酸序列进行改变而增强；6)通过对编码酶的核苷酸序列进行改变而增强。7.根据权利要求5或6所述的重组微生物，所述重组微生物为棒状杆菌属细菌；优选为谷氨酸棒状杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：康培，王治权，宫卫波，何君，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：