一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法，属于生物检测技术领域。所述试剂盒包括crRNA，crRNA为crRNA

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法


[0001]本专利技术涉及一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法，属于生物检测


技术介绍

[0002]牛病毒性腹泻又称牛病毒性腹泻
‑
黏膜病（bovine viral diarrhea
‑
mucosaldisease，BVD
‑
MD）是由牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的一种较强的传染病。该病毒除感染牛外，还可感染猪、鹿、羊、骆驼、兔及其他野生反刍动物，目前已报道感染40多种动物，宿主相当广泛。据报道，目前BVDV有三种基因型分别为BVDV
‑
1、BVDV
‑
2和BVDV
‑
3。
[0003]其中，BVDV
‑
3是一种新出现的侵染牛的瘟病毒，其临床表现形式与BVDV
‑
1和BVDV
‑
2 引起的临床症状相似，BVDV
‑
3的氨基酸序列与BVDV
‑
1和BVDV
‑
2相比具有较高的同源性，但抗原性明显不同。所以，对该病毒进行基因分型检测尤为重要。
[0004]目前对BVDV病毒的检测方法主要有病原学检测、血清学检测和分子生物学检测。病原学检测有电镜检查、间接免疫荧光染色技术（IFA）、但因为电镜检查对设备的要求较高，只适用于实验室检查；IFA技术由于检测周期长，操作繁琐固不适用于规模化牛场的大规模筛查；血清学检测中使用最广泛的为酶联免疫吸附试验（ELISA）。商品化抗原捕获ELISA试剂盒可用于确认BVDV感染，但无法区分是BVDV
‑
1、BVDV
‑
2和BVDV
‑
3哪一分型感染。分子生物学检测包括反转录
‑
多聚酶链式反应（RT
‑
PCR）和基因芯片，但基因芯片价格昂贵，筛查成本极高。并且以上方法主要针对BVDV
‑
1和BVDV
‑
2进行检测，而没有BVDV
‑
3的相关检测方法。因此，亟需提供一种简单快速，且灵敏度、特异性高的特异性片段以及检测方法。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒与检测方法。
[0006]本专利技术技术方案如下：一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的crRNA，所述crRNA为crRNA
‑
1和crRNA
‑
2的组合；所述crRNA
‑
1的序列如SEQ ID NO.1所示；所述crRNA
‑
2序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的crDNA，所述crDNA为crDNA
‑
1和crDNA
‑
2的组合；所述crDNA
‑
1的序列如SEQ ID NO.3所示；所述crDNA
‑
2序列如SEQ ID NO.4所示。
[0008]一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的DNA，所述DNA为DNA
‑
1和DNA
‑
2的组合；所述DNA
‑
1的序列如SEQ ID NO.5所示；所述DNA
‑
2序列如SEQ ID NO.6所示。
[0009]所述crRNA
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1和crRNA
‑
2可以通过人工合成得到，或以crDNA
‑
1和crDNA
‑
2为模板转录得到，所述DNA
‑
1是使用crRNA
‑
1鉴别检测BVDV
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3的靶向序列1，所述DNA
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2是使用crRNA
‑
2鉴别检测BVDV
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3的靶向序列2，均用于鉴别检测BVDV
‑
3毒株。
[0010]一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒，所述试剂盒包括上述crRNA或
crDNA。
[0011]进一步优选的，所述试剂盒还包括Cas蛋白；进一步优选的，所述Cas蛋白为Cas13a蛋白。
[0012]根据本专利技术优选的，所述试剂盒包括胶体金试纸条、胶体金试纸条卡壳和微孔杯。
[0013]根据本专利技术优选的，所述胶体金试纸条包括底板，以及依次衔接贴合于底板的样品垫、连接垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；所述硝酸纤维素膜上依次设置有第一检测线、第二检测线和控制线。
[0014]根据本专利技术优选的，所述第一检测线上固定有FAM单克隆抗体，所述第二检测线上固定有Dig单克隆抗体，控制线上固定有Biotin配体。
[0015]一种利用上述试剂盒以非诊断目的检测牛病毒性腹泻病毒3型的方法，其特征在于，所述方法包括步骤如下：（1）提取待测样本的基因组；（2）以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和聚合酶的反应体系中，进行双重RT
‑
RPA扩增；（3）取RT
‑
RPA扩增产物分别建立T1检测体系和T2检测体系，在37℃下孵育10~60min；（4）将T1检测体系和T2检测体系按照等体积混合均匀，再加入无酶水得到反应液，然后将反应液滴入微孔杯中，5~10分钟后，当第一检测线显示条带或第二检测线显示条带或第一检测线和第二检测线均显示条带时，表明待测样本感染BVDV
‑
3型毒株；当第一检测线和第二检测线均不显示条带，控制线显示条带时，表明待测样本未感染BVDV
‑
3型毒株。
[0016]根据本专利技术优选的，步骤（1）中，所述待测样本为牛鼻拭子或唾液样本，具体是将牛鼻拭子或唾液用TCEP（100mM）和EDTA（1mM）混合缓冲液先进行50℃、5分钟处理，再进行65℃、5分钟处理后获得。
[0017]根据本专利技术优选的，步骤（2）中，所述双重RT
‑
RPA扩增为同时使用两对引物进行RT
‑
RPA扩增，引物序列为：正向引物1：5'
‑
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGAAAGTGAAGCACCAAGGRAACTTAAGAAC
ꢀ‑
3'；反向引物1：5'
‑
TTTCTTTTCCAGGAACCCTGCTGCTCCTTT
‑
3'；正向引物2：5'
‑
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTACTAGAAGGAGACMAAATGAAGGTGGCTT
‑
3'；反向引物2：5'
‑
GGAGGAAGCTGAATGCCACTGCYTTCTCATA
‑
3'。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的crRNA，其特征在于，所述crRNA为crRNA
‑
1和crRNA
‑
2的组合；所述crRNA
‑
1的序列如SEQ ID NO.1所示；所述crRNA
‑
2序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的crDNA，其特征在于，所述crDNA为crDNA
‑
1和crDNA
‑
2的组合；所述crDNA
‑
1的序列如SEQ ID NO.3所示；所述crDNA
‑
2序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的DNA，其特征在于，所述DNA为DNA
‑
1和DNA
‑
2的组合；所述DNA
‑
1的序列如SEQ ID NO.5所示；所述DNA
‑
2序列如SEQ ID NO.6所示。4.一种用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA或权利要求2所述的crDNA。5.如权利要求4所述的用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas13a蛋白。6.如权利要求4所述的用于检测牛病毒性腹泻病毒3型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括胶体金试纸条、胶体金试纸条卡壳和微孔杯；所述胶体金试纸条包括底板，以及依次衔接贴合于底板的样品垫、连接垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；所述硝酸纤维素膜上依次设置有第一检测线、第二检测线和控制线；所述第一检测线上固定有FAM单克隆抗体，所述第二检测线上固定有Dig单克隆抗体，控制线上固定有Biotin配体。7.一种利用权利要求6所述试剂盒以非诊断目的检测牛病毒性腹泻病毒3型的方法，其特征在于，所述方法包括步骤如下：（1）提取待测样本的基因组；（2）以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和聚合酶的反应体系中，进行双重RT
‑
RPA扩增；（3）取RT
‑
RPA扩增产物分别建立T1检测体系和T2检测体系，在37℃下孵育10~60min；（4）将T1检测体系和T2检测体系按照等体积混合均匀，再加入无酶水得到反应液，然后将反应液滴入微孔杯中，5~10分钟后，当第一检测线显示条带或第二检测线显示条带或第一检测线和第二检测线均显示条带时，表明待测样本感染BVDV
‑
3型毒株；当第一检测线和第二检测线均不显示条带，控制线显示条带时，表明待测样本未感染BVDV
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3型毒株。8.如权利要求7所述的以非诊断目的检测牛病毒性腹泻病毒3型的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李学洋，王国俊，韩琪，李怀珠，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：