一种改造后的先导编辑系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种改造后的先导编辑(Prime editing，PE)系统及其应用。所述改造后的先导编辑系统包括改造后的pegRNA、PE蛋白或其编码序列和sgRNA，其中所述的pegRNA由Spacer序列、改造后的scaffold序列、引物结合序列及逆转录序列组成，所述的改造后的scaffold序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术提出的改造后的PE系统与现有的PE系统相比，可显著提高PE系统在目标位点定点突变、小片段定点插入和小片段定点缺失的效率。该改造后的PE系统对定点突变的提高率达1.9倍，对小片段定点插入的提高率达1.5倍，对小片段定点缺失的提高率达2.0倍，基因编辑效率显著高于现有技术，且脱靶效率无显著变化，本发明专利技术的提出促进了先导编辑系统的推广与应用，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种改造后的先导编辑系统及其应用


[0001]本专利技术涉及一种改造后的先导编辑系统及其应用。本专利技术属于生物


技术介绍

[0002]先导编辑(Prime editing，PE)系统是由Anzalone等人于2019年开发的一种基于“搜索和替换”的新型基因组编辑工具，此系统无需在被编辑生物基因组中引入双链断裂和供体DNA模板即可实现小片段插入、缺失及四种碱基的任意替换。最早的PE系统由改造后的引导RNA——pegRNA和prime editor蛋白组成，其中pegRNA由spacer、scaffold和引物结合序列(Primer binding site，PBS)及逆转录序列(Reverse transcriptase，RT)组成，行使搜索功能并将RT序列的编辑信息逆转录至编辑位点，prime editor蛋白由逆转录酶和Cas9切口酶融合而成。该系统弥补了CRISPR/Cas9、ABE、CBE等编辑工具编辑类型有限、indel发生率高及易产生脱靶效应方面的不足，在生物领域具有广阔的应用前景，如通过精确的单碱基编辑研究SNP的功能或通过饱和突变研究某个基因序列的功能。目前，研究人员已经验证了PE系统在植物、动物模型和人类细胞中进行基因组编辑的有效性。Liu等首次采用PE系统建立了Hox
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D13(Hoxd13)基因编辑小鼠模型。Lin等首次将该系统应用于植物基因组编辑。尽管PE系统在动物和植物中均成功进行了编辑，但是与ABE或CBE编辑系统相比，PE系统在小鼠胚胎中显示出更低的编辑效率。因此，PE系统较低的编辑效率是限制其广泛使用的瓶颈。
[0003]研究人员为了提高PE系统的编辑效率，对逆转录元件进行优化，提高其对RT序列的逆转录效率，并基于此开发了编辑效率显著提高的二代先导编辑系统—PE2。为了进一步提高PE编辑器的效率，科学家在PE编辑位点附近引入sgRNA，其引导PE蛋白在编辑位点附近的未编辑链中形成单链切口，进而引发机体的DNA修复系统，提高编辑效率，基于这一操作构建的系统为PE3系统，但PE3系统在编辑过程中产生了双链切口，因此Indel比例较PE2技术有了一定程度的增加。针对这一问题，研究人员开发出了编辑时仅产生单链切口的PE3b系统，该系统中sgRNA靶向的目标序列为编辑成功的序列，因此nCas9只能作用于编辑成功的序列，使其产生单链切口，从源头上解决了PE3系统产生Indel比例较高的问题。除了以上措施，研究人员试图探究不同长度PBS序列与RT序列对编辑效率的影响，结果表明PBS序列与RT序列的长短对编辑效率有一定影响，但不同编辑位点的最适序列长度不尽相同，如PE系统编辑HEK 293T细胞的不同基因位点时，10
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16nt长度的序列均可达到满意的编辑效率。
[0004]研究表明，pegRNA的PBS
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RT序列不稳定，容易被RNA酶降解，从而导致PE系统的编辑效率低。Nelson等设计的全新pegRNA——epegRNA可有效防止pegRNA 3
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端的降解，进而提高PE系统的编辑效率。Liu等利用20nt的Cys4识别序列连接pegRNA和nick sgRNA形成了融合pegRNA序列，并将Csy4蛋白与PE蛋白融合表达，成功构建了ePE系统。在ePE系统中，Cys4识别序列提高了PBS序列与spacer序列的空间位阻，阻碍pegRNA形成二级结构，从而能够提高PE系统的编辑效率。Park等在PE系统中引入能够松动染色质结构的dead sgRNA，以此提高编辑效率。在核酸的结构与功能中，Tm值在DNA、RNA以及DNA/RNA杂合双链结构的稳
定具有重要作用。因此，高彩霞等就PBS的溶解温度对PE编辑器编辑效率的影响进行研究，发现在水稻中PBS溶解温度约为30℃时PE编辑器效率最高，为了进一步提高PE系统的编辑效率，研究者提供了一种双pegRNA的方法，引入两个pegRNA，其效率比单个pegRNA的编辑效率高约4.2倍。
[0005]到目前为止，鲜有学者关注pegRNA的scaffold结构对PE系统编辑效率的影响。pegRNA的scaffold结构与sgRNA的scaffold相同，通常由四部分组成：核心发夹、连结、小发夹和尾部发夹。这些引导RNA的scaffold主要有两个作用：一是招募Cas9蛋白进行基因编辑，二是稳定RNA的结构，因此scaffold也是影响编辑效率的一个重要因素。sgRNA scaffold中的核心发夹和小发夹被修改后能够影响其所在系统的编辑效率。在PE系统中，由scaffold自由能决定的pegRNA稳定性是影响PE系统编辑效率的一个潜在因素。在此，我们报告了一种改造后二级结构正确、自由能更低且更稳定的pegRNA scaffold，以提高PE系统的编辑效率。

技术实现思路

[0006]针对现有PE系统效率低的不足和实际需求，本专利技术提供了一种高效的PE系统及其应用，通过改造PE系统中pegRNA的scaffold序列，保证其正确二级结构的基础上降低自由能，可显著提高PE系统的编辑效率，且无需进行额外的实验操作，不影响正常实验进程，操作简单，使用方便，应用前景广阔。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一方面，本专利技术提出了一种改造后的scaffold序列，其特征在于，所述的改造后的scaffold序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]原始scaffold的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0010]本专利技术中，scaffold序列的改造是依据sgRNA与Cas9蛋白作用的晶体结构模型，在维持其正确二级结构的基础上依据自由能最小原则在core hairpin和small hairpin区域进行的(如图1所示)，改造后的scaffold序列二级结构正确、自由能低、稳定性高(如图2所示)。本专利技术使用改造后的scaffold序列构建靶向HEK293T和HeLa细胞中共30个位点的pegRNA，并结合PE系统其他组分进行基因编辑效率验证，结果证明了使用改造后的scaffold序列代替PE系统中pegRNA原有的scaffold序列可显著提高PE系统的编辑效率(P<0.05)。
[0011]进一步的，本专利技术还提出了所述的改造后的scaffold序列在制备先导编辑系统中的应用。
[0012]另一方面，本专利技术还提出了一种改造后的先导编辑(Prime editing，PE)系统，所述的先导编辑系统包括改造后的pegRNA、PE蛋白或其编码序列和sgRNA，其中所述的pegRNA由spacer序列、改造后的scaffold序列、引物结合序列及逆转录序列组成，所述的改造后的scaffold序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]其中，优选的，所述的先导编辑系统包括PE蛋白
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sgRNA
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改造后的pegRNA复合物、PE mRNA与sgR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种改造后的scaffold序列，其特征在于，所述的改造后的scaffold序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的改造后的scaffold序列在制备先导编辑系统中的应用。3.一种改造后的先导编辑(Prime editing，PE)系统，其特征在于，所述的先导编辑系统包括改造后的pegRNA、PE蛋白或其编码序列和sgRNA，其中所述的pegRNA由Spacer序列、改造后的scaffold序列、引物结合序列及逆转录序列组成，所述的改造后的scaffold序列如SEQ ID NO.1所示。4.权利要求3所述的先导编辑系统，其特征在于，所述的先导编辑系统包括PE蛋白
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sgRNA
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改造后的pegRNA复合物、PE mRNA与sgRNA和改造后pegRNA组成的复合物、PE蛋白与sgRNA和改造后pegRNA表达质粒的组合物、PE蛋白编码质粒与sgRNA和改造后pegRNA表达质粒、PE蛋白
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pegRNA复合物、PE mRNA和pegRNA组成的复合物、PE蛋白和pegRNA表达质粒的组合物、PE蛋白编码质粒与pegRNA表达质粒组合物中的任意一种。5.一种提高先导编辑系统基因编辑效率的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求3或4所述的先导编辑系统进行哺乳动物细胞或受精卵的基因组编辑，包括以下步骤：将权利要求3或4所述的先导编辑系统导入受体...

【专利技术属性】
技术研发人员：王小龙，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：