一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基及制备方法技术

本发明专利技术提供了一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基及其制备方 法，按常规方法配制RPMI 1640完全培养基，然后分别与一定比例的BHK-21、 CRFK、Hela等细胞的无细胞培养上清混合，完全培养基与每种细胞上清的体积 比为(7～1)∶1。本发明专利技术的优点在于：使用本发明专利技术所提供的杂交瘤细胞克隆用培 养基，可完全省略在常规杂交瘤细胞克隆过程中以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作 为饲养细胞的环节，大大简化了克隆操作，并使被克隆细胞的生长速度明显提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，尤其是提供了一种制备单克隆抗体的交瘤细胞克隆用培养基及制备方法。
技术介绍
单克隆抗体以其高度的特异性和灵敏度，在免疫学检测、目的蛋白的亲和纯化和肿瘤治疗领域得到广泛应用。目前在单克隆抗体制备过程中，对阳性杂交瘤细胞孔应用1640完全培养基并采用有限稀释法进行克隆，此条件下克隆细胞生长缓慢。为促进单个细胞的快速增殖，通常在克隆前首先制备JH常BALB/c的腹腔巨噬细胞悬液，然后以2X10' 2Xl()5细胞/孔加到待克隆板中。该过程需要在细胞克隆前制备，不同操作者制备的腹腔巨噬细胞数量差异较大，并且受动物个体差异影响，不利于克隆过程的标准化，同时还增加了污染的几率。
技术实现思路
本专利技术提供了一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基，克服了常规杂交瘤细胞克隆过程中制备腹腔巨噬细胞的繁琐过程。本专利技术还提供了一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基的制备方法，适用于单克隆抗体的生产。本专利技术制备的单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基，主要由以下原料按体积份数比组成1640完全培养基7 1份，传代细胞上清1份；所述的传代细胞上清为细胞对数生长前期的培养液，通过离心获得无细胞上清液。传代细胞选自BHK-21、 CRFK、 Hela传代细胞系中的一种。本专利技术培养基的制备工艺包括以下步骤1) 1640无血清培养基的配制将RPMI 1640、 H印es、 NaHCO:i用去离子水溶解，调pH值至7. 0后定容到1000毫升，0.22um滤膜过滤除菌，无菌分装；2) 双抗的配制配制含青霉素100万单位、链霉素100万单位的双抗溶液；3) 1640完全培养基的配制取79毫升步骤1的1640无血清培养基，加入胎牛血清20毫升、双抗溶液l毫升；4) 传代细胞培养基的配制取89毫升步骤1的1640无血清培养基，加入胎牛血清10毫升、双抗溶液 l毫升；5) 传代细胞的培养及上清的收集传代细胞上清为细胞对数生长前期的培养液，通过离心获得无细胞上清液， 传代细胞选自BHK-21、 CRFK、 Hela传代细胞系中的一种；6) 制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基将步骤3制备的1640完全培养基与歩骤5的传代细胞上清按体积比(7 1): l混合，并将混合培养基的pH值调到7.2，即获得本专利技术的制备单克隆抗体的杂 交瘤细胞克隆用培养基，分别命名为朋K-1640、 CRFK-1640、 Hela-1640。试验例应用本专利技术所制备的培养基分别对SP2/0细胞和抗狂犬病病毒单克隆抗体 分泌细胞进行克隆，并与常规克隆方法进行比较。操作步骤如下1.BALB/c腹腔巨噬细胞悬液的制备摘除健康BALB/c小鼠一侧眼球，待血 液将流尽的濒死期拉颈处死，浸泡于75%的无水乙醇溶液中15min，然后在超净 工作台中按常规方法制备用完全1640培养基稀释的腹腔巨噬细胞悬液，并以2 X 107ml的密度加入到96孔培养板中，每孔100 u 1 。2. 本专利技术的培养基加到细胞培养板将BHK21、 CRFK、 Hela等细胞的无细胞 培养上清与完全1640培养基(按体积比)1: 3混合所制备的杂交瘤细胞克隆用 培养基，以每孔100u 1的量加到96孔培养板中，每种培养基设32个重复孔。3. 将处于对数生长期的SP2/0细胞和抗狂犬病病毒单克隆抗体分泌细胞分别 用1640完全培养基和不同的杂交瘤细胞克隆培养物稀释到10个/ml，然后分别 加入到含相同培养基的培养板中，每孔lOOwl,置37°C 5% C02条件下培养。 分别于第6天和第9天时每孔更换100ii 1相同培养基，到第12天时检测克隆大 小和分泌抗狂犬病病毒单克隆抗体的克隆细胞孔上清的效价。以相同培养条件下 有克隆细胞生长孔细胞集落直径(平均数士标准差)和抗体效价(0D )作为判 断依据。表1.本专利技术与现有培养基的比较__<table>table see original document page 4</column></row><table>CRFK-1640 1483±585.5 1508±623.2 1. 13±0. 16Hela-1640 1527±513.4 1462±483.9 0.98±0. 25完全164Q 987±330.7 1028±455.6 0.86±0. 18如表1所见，当克隆细胞生长到第12天时，无论是SP2/0还是分泌单克隆 抗体的细胞，用3种不同的杂交瘤细胞克隆用培养基所形成的细胞集落直径不仅 大于常规培养基所形成的集落直径，而且上清中所分泌的抗体效价也高于常规培 养基所分泌的效价。进一歩比较还发现，3种杂交瘤细胞克隆用培养基中以含BHK21-1640培养基在细胞集落直径和抗体效价方面均优于CRFK-1640和 Hela-1640培养基。本专利技术的积极效果在于提供了一种可简化杂交瘤细胞克隆过程的培养基及 其配置方法，通过SP2/0细胞和分泌抗狂犬病病毒的杂交瘤细胞的克隆试验表 明，本专利技术所提供的培养基可完全代替现有培养基。当用有限稀释法对杂交瘤细 胞进行克隆，不仅省去了常规杂交瘤细胞克隆过程中制备腹腔巨噬细胞的繁琐过 程，而且使克隆生长速度及所分泌的抗体效价也得到明显提高。本专利技术的另一个优点在于极大地消除了因小鼠个体和人为因素对克隆过程 所产生的影响，有利于克隆过程的标准化，而且操作简便，因此具有潜在的商业 化前景。具体实施例方式为了便于理解本专利技术，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本专利技术的阐 释而非对本专利技术的任何形式的限制。 实施例1杂交瘤细胞克隆用培养基的制备工艺，包括以下步骤1) 1640无血清培养基的配制将RPMI 1640(干粉)(GIBC0公司生产)IO. 4克、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(冊PES， 上海生工，分析纯)3.574克、NaHC03 (北京化工厂，分析纯)2克用去离子 水900毫升，调pH值至7. 0后定容到1000毫升，0. 22um滤膜过滤除菌，无菌分装待用；2) IOO倍浓縮双抗的配制将青霉素100万单位、链霉素100万单位依次溶于100ml去离子水中，用 0.22um滤膜过滤除菌，制成双抗溶液，分装小瓶后置-2(TC保存待用；3) 1640完全培养基的配制取79毫升歩骤1制备的1640无血清培养基，加入胎牛血清(GIBCO公司生 产)20毫升、双抗l毫升待用；4) 传代细胞培养基的配制取89毫升歩骤1制备的1640无血清培养基，依次加入胎牛血清10毫升、 双抗l毫升待用；5) 单层细胞消化液(IOX贮存液)配置取牛胰蛋白酶2. 5克、氯化钠40克、氯化钾2. 0克、葡萄糖5. 0克、NaHCO:, 2.9克、EDTA 1.0克，依次溶于450毫升三馏水中，待胰酶完全溶解后，加入 1%酚红，并加三馏水至500毫升，0.22Wn滤膜过滤后除菌，-20"保存待用；6) 传代细胞的培养及上清的收集 (1)朋K-21细胞的培养和上清的收集从液氮罐中取出BHK-21细胞冷冻管，立即投入37°C水浴中快速解冻，轻 摇冷存管使其在l分钟内全部融化。200g/min离心5分钟，在超净工作台内无 菌吸弃上清，用适量传代细胞培养液悬浮后，接种于细胞培养瓶中，置37。C恒 ^i肯，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆用培养基，主要由以下原料按体积份数比组成的：　１６４０完全培养基７～１份，传代细胞上清１份；　所述的传代细胞上清为细胞对数生长前期的无细胞上清液，传代细胞选自：ＢＨＫ－２１、ＣＲＦＫ、Ｈｅｌａ传代细胞系中的一种。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张茂林，段铭，关振宏，王心蕊，陈启军，柳增善，
申请(专利权)人：张茂林，段铭，关振宏，王心蕊，陈启军，柳增善，
类型：发明
国别省市：82