制备含ＥＢ病毒潜伏膜蛋白１，２基因的重组腺相关病毒及其应用制造技术

制备含ＥＢ病毒潜伏膜蛋白１，２基因的重组腺相关病毒及其应用，本发明专利技术它携带有编码ＥＢ病毒潜伏膜蛋白１，２的ＤＮＡ序列，如ＣＣＴＣＣ?ＮＯ：Ｖ２００９０７所述。其中所说的重组腺相关病毒的病毒滴度不小于１×１０１１／ｍｌ?ｖｉｒａｌ?ｐａｒｔｉｃｌｅｓ。所说的重组腺相关病毒可在体内诱导ＥＢ病毒特异性细胞毒性淋巴细胞反应。制备本发明专利技术方法包括：１）将编码ＬＭＰ１，ＬＭＰ２和ＨＳＰ７０蛋白质的ＤＮＡ序列克隆到适当的腺相关病毒载体质粒中，得到携带ＬＭＰ１，ＬＭＰ２和ＨＳＰ７０之ＤＮＡ编码序列的重组腺相关病毒载体质粒。２）用步骤１的重组腺相关病毒载体质粒和辅助质粒共转染适当的包装细胞，得到所需的重组腺相关病毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
具体地说是ー种含EB病毒潜伏膜蛋白1，2和热休克蛋白70基因的重组腺相关病毒制备方法，以及该重组腺相关病毒在预防和治疗EB病毒相关肿瘤的疫苗中的应用。
技术介绍
鼻咽癌为上皮源性恶性肿瘤。传统的鼻咽癌治疗是以放射治疗为主，以诱导化疗为辅。这种传统的治疗模式在过去几十年里，发挥了很大的作用，挽救了许多患者的生命。但是，晩期鼻咽癌占NPC总病例的70%，其5年生存率一直未见提高，治疗失败的主要原因是局部未控、复发和远处转移。如何进ー步提高鼻咽癌的治疗效果，特别提高晚期及耐药病人的生存率，是摆在 我们面前的ー个急待解决的问题。近年来，大量实验资料证明EB病毒与鼻咽癌密切相关。EB病毒膜蛋白LMPl和LMP2是在鼻咽癌中仅有的可诱发特异性免疫反应的靶抗原，可作为治疗性疫苗的靶点。Khanna R通过构建重组痘病毒，体内和体外实验中观察到LMPl特异的CTL反应，动物实验中该疫苗能使肿瘤消退。Duraiswamy等用LMPl多表位聚合的疫苗可在体内和体外实验中观察到LMPl特异的CTL反应，动物实验中该疫苗能使肿瘤消退。以痘病毒或腺病毒载体的疫苗能够刺激免疫系统，但是这也同时带来病毒感染的风险，特别是对于免疫缺陷的病人。国内曾毅等专利技术了一个携带EB病毒潜伏膜蛋白2的DNA编码序列的复制缺陷型重组腺病毒，并提出了 3项申请。含EB病毒潜伏膜蛋白2基因的重组腺病毒疫苗，公开号CN1548532 ;含重组质粒和复制缺陷型重组腺病毒的联合免疫制剂，公开号CN1927405 ;含EB病毒潜伏膜蛋白2基因的Ad5F35-LMP2重组腺病毒疫苗，公开号CN1907493，但该项研究也是基于腺病毒载体系统，然而腺病毒有致病性，应用于免疫力低下的肿瘤患者会带来感染风险。为避免感染风险，就必须选取ー个安全、高效的适合治疗的基因表达载体。重组腺相关病毒(又名依赖性腺联病毒)是目前基因治疗载体系统研究的热点之一，同时也是最安全的ー种载体。
技术实现思路
本专利技术的ー个目的是提供一种重组腺相关病毒，它携带有编码EB病毒潜伏膜蛋白1，2的DNA序列。本专利技术的另ー个目的是提供生产如上限定的重组腺相关病毒的方法，本专利技术的再ー个目的是提供如上限定的重组腺相关病毒作为EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗的应用。本专利技术的病毒携帯有编码EB病毒潜伏膜蛋白1，2的DNA序列，已如2009年4月16日送中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO :V200907，分类命名依赖性腺联病毒2型病毒rAAV-LMP2/l-hsp所述。本专利技术含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组腺相关病毒，其中所说的重组腺相关病韋的病韋滴度不小于I X 10n/ml viral particles。本专利技术含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组腺相关病毒，其中所说的重组腺相关病毒可在体内诱导EB病毒特异性细胞毒性淋巴细胞反应。制备本专利技术含EB病毒潜伏膜蛋白1，2基因的重组腺相关病毒，该方法包括I)将编码LMP1，LMP2和HSP70蛋白质的DNA序列克隆到适当的腺相关病毒载体质粒中，得到携带LMP1，LMP2和HSP70之DNA编码序列的重组腺相关病毒载体质粒。2)用步骤I的重组腺相关病毒载体质粒和辅助质粒共转染适当的包装细胞，得到所需的重组腺相关病毒。根据本专利技术 方法的一个实施方案，其中所说的腺相关病毒载体质粒是质粒pAAV (D+)。根据本专利技术方法的一个实施方案，其中所说的腺相关病毒辅助质粒是质粒pHelper 和 pXX2。根据本专利技术方法的一个实施方案，其中所说的腺相关病毒包装细胞是293细胞。根据本专利技术方法的一个实施方案，其中所说的疫苗的靶抗原是EB病毒的潜伏膜蛋白I和2.根据本专利技术方法的一个实施方案，其中所说的重组腺相关病毒可在体内诱导抗EB病毒潜伏膜蛋白I和2特异性抗体生成反应和特异性细胞毒性淋巴细胞反应。本专利技术用于基因治疗具有显著的优点(I)抗原性，毒性很小，不致病，安全性好；(2)基因组小而易于操作。大部分基因可被替代而保留感染能力；(3)感染谱广，可感染分裂期和非分裂期细胞；(4)利用包装细胞，在体外可制备高滴度病毒；放射线照射可以使病毒从潜隐感染进入复制状态，为基因治疗联合放射治疗创造了条件。(5)可以有效地转导脑、骨骼肌、肝脏等许多类型的细胞。同吋，我们利用热休克蛋白HSP70与LMPl和LMP2构建融合基因白。结核分枝杆菌HSP70不仅能诱导特异性Thl型细胞反应，还直接參与和促进抗原的提呈与识别，激活自然杀伤细胞，诱导巨噬细胞分泌ILl a、ILl P、肿瘤坏死因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等多种细胞因子，发挥类似免疫佐剂的功能，能够增强针对LMPl和LMP2表位的特异性细胞免疫反应。附图说明图lrAAV-LMP2/l_HSP重组腺相关病毒载体质粒的结构示意图图2被免疫BABL/c小鼠血清中LMP2抗体的检测rAAV-LMP2/l-HSP免疫小鼠的可诱导特异性的体液免疫。图3rAAV LMP2/1CTL-HSP 疫苗诱导的 CTL 反应图3aSP2/0_LMP2 细胞；图3b SP2/0 细胞；图 3cSP2/0 细胞 +LMP2p印tide131_139，图3dSP2/0细胞+非特异性肽。结果显示，rAAV-LMP2/l-HSP免疫后的小鼠对SP2/0-LMP2细胞有明显的CTL效应图4重组腺相关病毒疫苗的预防性作用(A)五天监测一次肿瘤直径，计算肿瘤体积；(B) 5周后杀死小鼠，肿瘤称重。结果显示，rAAV-LMP2/l-HSP免疫小鼠的肿瘤生长明显抑制。图5重组腺相关病毒疫苗的治疗性作用rAAV-LMP2/l_HSP免疫小鼠的生存时间明显延长。具体实施方式以下实例用来说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1 :rAAV-LMP2/l_HSP重组腺相关病毒的构建1. pAAV-LMP2/l-HSP重组腺相关病毒载体质粒的构建(I)大肠杆菌感受态细胞的制备取出-80°C保 存的E. Coli DH5 a菌种，用接种环挑取少量菌液在LB琼脂板上划线，37°C倒置培养过夜；次日挑取单个DH5a菌落，接种于3ml LB培养基(不含抗生素，)中，置37°C摇床280rpm振摇过夜；次日取上述菌液0. 5ml接种于50mlLB培养基中，37°C摇床280 300rpm振摇至菌液OD值A600达到0. 4 0. 6时取出；4°C 5，OOOrpm离心IOmin,弃上清，用20ml预冷CaCl2 (0. lmol/L)重悬细菌,冰浴30min后4°C 5, OOOrpm离心IOmin,同样弃上清，再用2ml预冷CaCl2 (0. lmol/L)重悬细菌；按每管IOOiU分装后继续冰浴Ih以上或置4°C过夜后即可使用。如要长期保存，可加入30%甘油，置于_80°C冰箱保存。(2)质粒的小量制备、酶切和电泳分析为了小量制备携带LMPl、LPM2 和 HSP70 基因的质粒 pMD18T_LMPl、pMD18T_LMP2pMD18T-HSP70(均为本试验室克隆和构建)，首先按已知方法用质粒(Iyl)转化如上的大肠杆菌细胞。取连接反应物10 Ul加入200 ill感受态细菌中，轻轻旋转混匀，冰上放置30分钟JfEp管放入42本文档来自技高网...

【技术保护点】
含ＥＢ病毒潜伏蛋白１，２基因的重组腺相关病毒，特征在于：该病毒携带有编码ＥＢ病毒潜伏膜蛋白１和２的ＤＮＡ序列如ＣＣＴＣＣ　ＮＯ：Ｖ２００９０７所述。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：汪道文，潘建青，肖啸，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]