本发明专利技术公开了ＨＬＡ－Ｇ抗原决定簇及其序列位置以及利用ＨＬＡ－Ｇ抗原决定簇制备ＨＬＡ－Ｇ抗体的方法。利用ＨＬＡ－Ｇ的抗体制备超敏感的化学发光免疫分析等试剂盒，用于检测早期肿瘤患者体液中所含极低含量的ＨＬＡ－Ｇ，以便诊断早期肿瘤；利用ＨＬＡ－Ｇ抗体制备操作简便、不使用仪器、能够自检自测的金标免疫分析检测ＨＬＡ－Ｇ的试剂盒，用于基层筛查、监测早期肿瘤，把肿瘤消灭在萌芽状态，以便提高肿瘤患者的生存率；利用ＨＬＡ－Ｇ的抗体为重要原料制备广谱抗肿瘤生物制剂和广谱肿瘤疫苗，用于治疗和预防恶性肿瘤。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药中的免疫化学领域。其中包含利用HLA-G分子抗原决定簇制 备HLA-G多克隆抗体及单克隆抗体；利用本法制备的HLA-G抗体为主要原料制备各种类型 免疫分析诊断肿瘤的试剂盒、广谱抗肿瘤生物制剂和广谱肿瘤疫苗，用于肿瘤早期诊断、生 物治疗和肿瘤预防，以期提高肿瘤患者的生存率。
技术介绍
肿瘤是一种常见病和多发病，发病率居第二位，死亡率占第一位。据世界卫生组织 1997年报告称全球肿瘤患者每年死亡人数高达660万，到2020年全球的肿瘤患者将达到 1500万。各种恶性肿瘤严重地威胁着人类的身体健康。在肿瘤发病的早期往往没有自觉症 状，一旦发觉自觉症状时已到无法治疗的中晚期。在肿瘤发病机理和治疗问题尚未彻底解 决的今天，要降低肿瘤患者死亡率必须开展基层肿瘤筛查工作，做到早发现早治疗。尽管研究人员已经发现了多种肿瘤相关抗原，例如AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗 原)、CA15-3、CA19-9、CA50、CA125、PSA等等。由于免疫分析具有高度的特异性、专一性，所 以利用某种肿瘤相关抗原只能检测其对应的一种肿瘤。如果要检查体内是否存在常见的某 些肿瘤必须作多项检查。1987年Geraghty等(1)发现并克隆了 HLA-G。HLA-G是人类白细胞抗原(HLA) I 组中非经典的组织相容性抗原。在正常组织中不存在。HLA-G最初发现于胎盘绒毛细胞滋 养层。初期有关HLA-G的研究集中于胎儿同母亲之间的免疫耐受(2)。由于胎盘分泌HLA-G 使母体产生免疫耐受，从而使胎儿避免了母体的排斥作用。近20年，HLA-G已成为重要的免 疫分子，在免疫、生殖、肿瘤、器官移植等方面作为一种免疫抑制剂发挥着重要作用(3)。由 于恶性肿瘤细胞能够表达和分泌HLA-G，恶性肿瘤才得以逃避人体免疫监视，使其快速生长 和扩散。免疫组化检测结果证实在喉癌、食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢 癌、子宫癌等多种恶性肿瘤组织中都能表达HLA-G。大量实验证明，HLA-G是一个具有高度肿瘤特异性的肿瘤标志物，在恶性肿瘤的表 达具有普遍性。在肿瘤发生和发展过程中其水平在血液、其它体液及肿瘤组织中增高。因 此检测HLA-G能广泛地应用于各种常见恶性肿瘤的诊断。通过检测HLA-G便可探明受检者 体内是否存在常见的各种恶性肿瘤。因此我们有理由称HLA-G为“肿瘤共同抗原”。由于HLA-G在恶性肿瘤表达具有普遍性，所以研究制备HLA-G抗体对肿瘤诊断、治 疗和预防具有重要价值。叶尚勉(4)利用HLA-G整个分子免疫小鼠制备了 HLA-G单克隆抗 体，并利用此单克隆抗体制备了检测HLA-G的免疫组化试剂盒。免疫组化试剂盒检测的样品来源于肿瘤手术或肿瘤组织活检制成的肿瘤组织切 片。因样品来源麻烦和困难，所以该方法用于检测肿瘤具有局限性，难以广泛应用于临床肿 瘤诊断。再者免疫组化反应原理是基于ELISA反应为基础，所以该方法的敏感度比化学发 光等免疫分析技术的敏感度为低。第三免疫组化试验不能定量，不能形成自动化操作。最 后免疫组化试验操作繁琐，试验用时较长。利用HLA-G完整分子免疫小鼠制备单抗或多抗，HLA-G的样品必须经过复杂的纯 化过程。否则所制备的单抗或多抗会产生交叉反应。另外超敏感可定量的免疫分析方法需 要大量的抗原HLA-G作为标准品，依靠从胎盘制备HLA-G很难满足临床免疫分析和免疫治 疗需求。为了寻求简便制备HLA-G免疫原，大量制备HLA-G抗体，为了避免使用HLA-G完 整分子制备抗体，简化制备抗体的手续，降低交叉反应，提高抗体的特异性，我们利用HLA-G 分子的抗原决定簇制备了 HLA-G的抗体，取得了满意的结果。为了提高检测HLA-G的敏感度，利用本专利技术提供的单克隆抗体和多克隆抗体为主 要原料制成检测HLA-G的化学发光、电化学发光、时间分辨等超敏感的免疫分析试剂盒，用 于医院作为检测HLA-G确诊试剂盒。也可以制成操作简便，不需使用仪器，适合在家庭自检 自测，物美价廉的金标免疫分析试剂盒，用于基层筛查早期肿瘤。基层筛查出的阳性标本送 医院进行确诊检测。在肿瘤生物治疗方面，随着生物技术在医学领域的快速发展和从分子水平对发病 机制的深入研究，肿瘤生物治疗已经取得了快速发展。Milstein和kohler首先利用杂交 瘤技术制备出单克隆抗体(5)。通过淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术和基因工程技术制备 的单克隆抗体药物是生物技术药物领域的重要方面。单克隆抗体具有纯度高、效价高、特异 性高、血清交叉反应小等优点，在肿瘤的治疗中发挥着重要作用。尽管肿瘤生物治疗由于单 克隆抗体的问世获得了较快发展，许多精心设计的抗体药物在体外具有杀伤肿瘤细胞的作 用，然而在体内仍不能有效地把肿瘤除掉。肿瘤生物肿瘤至今未取得明显地突破。在肿瘤疫苗研制方面，目前世界各国主要存在重治疗轻预防倾向。当前人们普遍 认为解决肿瘤问题主要途径在于提高治疗手段，寻找有效的外科技术和研制杀死肿瘤细胞 的有效药物。然而事实证明单纯依靠目前常规外科手术和化疗并不能遏制住肿瘤死亡率向 上攀升的趋势。利用肿瘤疫苗预防肿瘤发生是遏制肿瘤死亡率上升的有效手段。利用肿瘤疫苗 可以起到预防肿瘤发生的目的，使人们由被动治疗变为主动预防，防范肿瘤于未然。然而 在当前的技术条件下，由于肿瘤种类繁多，对肿瘤的认识肤浅，人类研制肿瘤疫苗才刚刚起 步，到目前为止尚未研制成功安全、有效、实用的肿瘤疫苗，许多研究仅停留在实验室研究 阶段，许多理论问题和技术问题尚未得到彻底解决(6)。
技术实现思路
一、HLA-G抗原决定簇的确定从蛋白质文库中调出HLA-G分子一级结构，获得HLA-G分子氨基酸序列。根据免 疫学理论确定了 HLA-G分子抗原决定簇多肽抗原片段的位置和序列。例如抗原决定簇A的 序列位于HLA-G序列第83-103位；抗原决定簇B的序列位于HLA-G序列第106-129位；抗 原决定簇C的序列位于HLA-G序列第198到230位；抗原决定簇D的序列位于HLA-G序列 第283到315位，等等。HLA-G其它抗原决定簇不一一例句。每个抗原决定簇至少包含5个 氨基酸残基。二、制备抗原决定簇多肽抗原片段(1)人工合成法采用有机化学Fmoc固相合成法，得到多肽树脂，用三氟乙酸(TFA)将多肽与树脂切开、分离，得到粗制品多肽，经初步纯化后，再用高压液相色谱法 (HPLC)进行纯化，纯化后的样品再用高压液相分析，纯度达到98%以上。将纯化后的多肽 抗原片段冷冻干燥保存备用。(2)基因重组法利用本领域共知的酵母质粒基因重组方法，首先人工合成同抗 原决定簇相对应的核酸片段，然后将核酸片段分别同酵母质粒核酸进行重组，将重组后的 酵母质粒放回酵母细胞内进行培养、表达，收集培养液，进行分离，纯化，鉴定，得到同抗原 决定簇氨基酸序列相同的多肽抗原片段。用上述人工合成法和基因重组法获得的多肽抗原片段能够同HLA-G抗血清发生 特异性反应，而不能同经过HLA-G吸收后的HLA-G抗血清发生特异反应。三、HLA-G多克隆抗体的制备根据HLA-G抗原决定簇的氨基酸序列及上述制备抗原决定簇多肽抗原片段的方 法，制得多肽抗原片段。多肽抗原片段与可用的载体蛋白如血蓝蛋白等偶联，制成免疫原。 免本文档来自技高网...
【技术保护点】
ＨＬＡ－Ｇ抗体制备方法，其特征在于利用ＨＬＡ－Ｇ分子的抗原决定簇进行制备。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苏殿杰，韩苏，
申请(专利权)人：广州天美生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81
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