抗汞螯合物单克隆抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种抗汞螯合物单克隆抗体。所述单克隆抗体对汞螯合物具有特异性，所述的汞螯合物为汞－１－（４－异硫氨酸苄基）－乙二胺四乙酸－牛血清白蛋白偶联物和汞－乙二胺四乙酸。本发明专利技术的单克隆抗体滴度高、特异性强。本发明专利技术还提供一种抗汞螯合物单克隆抗体的制备方法与应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重金属免疫检测
，特别涉及一种抗汞螯合物单克隆抗 体及其制备方法与应用。
技术介绍
重金属污染给生态环境和人类健康带来严重的危害，特别是汞，因其复杂 性和毒性，引起了广泛关注，汞及其化合物所造成的污染问题日益严重，并通 过多种途径对人体呼吸系统、皮肤、中枢神经系统、肾脏和眼睛等造成严重伤害。早在20世纪50年代日本熊本水俣病爆发之后，汞的污染问题就引起了人 们的关注。近年来，随着城市化进程的不断加快和工业化水平的迅速提升，由 于生产、生活所致的示及其化合物污染日趋严重并再度成为全球热点问题之 一。因此，有关汞的排放、迁移、沉降以及控制研究已成为环境污染防治的新 兴领域之一。联合国粮农组织和世界卫生组织已1963年规定了食品中汞的最 大允许浓度为0.05mg/Kg(鲜重)，美国为0.5mg/Kg，我国食品卫生标准规定的 极限值为0.02mg/Kg。传统的重金属检测方法多采用化学仪器检测，例如原子吸收光谱分析 (atomic absorption spectroscopy, AAS)、电感诔禺合等离子发射光^普(inductively coupledplasma atomic emission spectroscopy , ICP-AES)等，这些方法需要对大 量的样品进行预处理，并且检测过程必须在集中大型分析仪器的室内进行，无 法用于现场检测，具有费用高、处理量有限、检测时间长等缺陷。因此，需要专利技术一种新的抗汞螯合物单克隆抗体及其制备方法与应用以解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的之一在于基于现有技术的不足而提供一种滴度高、特异 性强的抗汞螯合物单克隆抗体。本专利技术的另一个目的在于提供一种制备滴度高、特异性强的抗汞螯合物单 克隆抗体的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种检测速度快、费用低廉、灵敏度高和选择 性强的检测汞离子浓度的检测方法。本专利技术提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体对汞螯合物具有特异性，所述的汞螯合物为汞-l- (4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物 和汞-乙二胺四乙酸。作为本专利技术单克隆抗体的优选实施方式，所述的单克隆抗体与汞-l- (4-异硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物的反应的OD450值为2.4651-2.4691,与1- (4-异硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白反应的 OD4so值为0.056-0.0057,与BSA反应的00450值为0-0.005;对汞-乙二胺四乙 酸的交叉反应性为100%,对铅-乙二胺四乙酸、锌-乙二胺四乙酸、镉-乙二胺 四乙酸、镁-乙二胺四乙酸、铜-乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸的交叉反应性均 <10%。本专利技术的单克隆抗体滴度高、特异性强，能特异性识别汞-l-(4-异硫氨酸 节基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白偶联物和汞-乙二胺四乙酸。本专利技术还提供一种制备抗汞螯合物单克隆抗体的方法，所述方法包括下述6步骤(1) 制备免疫抗原汞-l- (4-异硫氨酸卡基)-乙二胺四乙酸-钥孔戚血蓝素 和包被抗原汞-l- (4-异硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白；(2) 将步骤(1)制备的免疫抗原免疫小鼠；(3 )将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合并培养； (4)采用竟争抑制法和包^C抗原筛选阳性克隆的杂交瘤细胞； (5 )鉴定上述步骤得到的杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体。 由于汞离子毒性较强而不能直接用作免疫原，所以制备抗汞离子的单克隆 抗体难以制备。本专利技术制备抗汞螯合物单克隆抗体的方法利用特异性的双功能 螯合剂螯合汞离子，成为能被动物免疫系统识别的汞-螯合剂复合物，再将之 与载体蛋白偶联，形成完整的免疫抗原。将免疫抗原用于制备单克隆抗体，得 到滴度高、特异性强的抗汞螯合物单克隆抗体。作为本专利技术制备抗汞螯合物单克隆抗体的方法的优选实施方式，所述步骤 (1)包括下述步骤A、 将牛血清白蛋白、钥孔戚血蓝素分别溶于pH9.5的磷酸盐緩冲液，浓 度为4 ~ 6mg/mL;B、 将10mg螯合剂溶于0.1mol/L， pH9.5的磷酸钠緩冲溶液，浓度为 18-22mg/mL,所述螯合剂为1- (4-异硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸；C、 按照1: 1的摩尔比，将螯合剂和Hg、容液混合，用氨水调节pH至 7.0-8.0,在20-30。C下搅拌反应12-36小时，合成半抗原；D、 取步骤C得到的2-4mg半抗原分别与等质量的步骤A得到的牛血清白 蛋白和钥孔戚血蓝素混合，分别用氨水调pH至8.5-9.5,在20-30。C下搅拌反 应12-36小时，分别合成包被抗原汞-l- (4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸-牛血清白蛋白和免疫抗原汞-l- (4-异硫氨酸千基)-乙二胺四乙酸-钥孔戚血蓝素。 抗原的制备中，控制各种溶液的浓度配比是关键，合适的方法可以达到提 高偶联率的作用。作为本专利技术优选实施方式，制备抗汞螯合物单克隆抗体的方法所述步骤 (3)中，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞以5~12: l混合，l分钟内加入 50%聚乙二醇融合，然后在120秒之内緩慢加入培养液，静置10分钟，离心， 采用常规方法培养。作为本专利技术进一步的优选实施方式，所述免疫小鼠的脾细 胞与骨髓瘤细胞以12: 1混合。在本专利技术抗汞螯合物单克隆抗体的制备方法中，细胞融合的操作也是一个 关4走点。专利技术人还意外发现，当采用免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞以12: 1 混合时，其融合率有大的提高。本专利技术还提供了 一种检测汞离子浓度的方法，其包括如下步骤 (1 )以抗汞螯合物单克隆抗体与抗原反应后在450nm的OD值为纵坐标Y，以汞离子的浓度为横坐标X,建立检测的标准曲线，线性方程为y=-0.0118x+ 0.7981，线性相关系数R^0.9941;(2 )将待测样品螯合螯合剂，所述螯合剂为l-(4-异硫氨酸苄基)-乙二胺四乙酸；(3) 将抗汞螯合物单克隆抗体与检测样品反应，测定反应液在450nm的 OD值；(4) 将步骤(3)得到的OD值代入步骤(1)的方程式中，得到检测样 品的汞离子浓度。汞离子能与蛋白质发生强烈的不可逆反应，导致蛋白质变性，因此，利用单克隆抗体无法直接识别并检测样品中的汞离子。本专利技术先利用螯合剂将汞离 子螯合，形成能被特异性单克隆抗体识别的汞螯合物，建立汞离子螯合物免疫 学检测方法。该方法检测速度快、费用低廉、灵敏度高并且选择性强。本专利技术 检测汞离子浓度的方法不仅能为食品安全检测，还能为我国农产品等的出入境 检测、环境监测提供有效的技术手段和检测方法。附图说明图1为本专利技术实施例2中牛血清白蛋白、半抗原Hg-ITCBE及偶联物的紫 外扫描图2为本专利技术实施例2中钥孔戚血蓝索、半抗原Hg-ITCBE及偶联物的紫 外扫描图3为本专利技术实施例2中利用Hg-ITCBE-BSA、 ITCBE-BSA包被的一次 阳性克隆的筛选结果；图4为本专利技术实施例2中阳性细胞林3C9G12的竟争抑制结合曲线；具体实施例方式为使本专利技术更加容易理解，下面将进一 步阐述本专利技术的具体实施例。 Hg"标准溶液，购于中国国家标准物质研究中心；l-(4-异硫 氰酸千基)乙二胺四乙酸，购于上海同仁化学研究所；羟乙基派溱乙磺酸 (hydroxyethylpi perazine ethanesuf本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体对汞螯合物具有特异性，所述的汞螯合物为汞－１－（４－异硫氨酸苄基）－乙二胺四乙酸－牛血清白蛋白偶联物和汞－乙二胺四乙酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王菊芳，李志勇，黄佳俊，王小宁，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]