一种高产β-榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种高产β

【技术实现步骤摘要】
一种高产
β
‑
榄香烯和germacrene A的重组菌的构建方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及到一种高产β
‑
榄香烯和germacre ne A的重组菌的构建方法。

技术介绍

[0002]β
‑
榄香烯是一种天然存在的倍半萜，主要通过从姜黄属植物中分离产生，是治疗各种癌症肿瘤的最广普的抗肿瘤药物之一，具有很广阔的应用前景和市场需求，而目前从姜科植物温郁金中提取的产量远远无法满足工业需求。而化学合成的生产方法成本高、收率低、不可再生，因此，利用底盘微生物绿色制造生产β
‑
榄香烯被寄予厚望。其生产效率涉及代谢途径的平衡表达、蛋白表达效率、关键酶的活性、副产物的积累、胞外运输等多种复杂的生理过程，解析这些生理过程对β
‑
榄香烯的生物合成有何影响效果及其影响机制对构建高产倍半萜的底盘细胞具有重要作用。
[0003]据研究，β
‑
榄香烯由germacrene A通过Cope
‑
Claisen重排生成，虽然β
‑
榄香烯已从姜黄属植物中提取，但其合成酶尚未被鉴定，因此生物研究使用ger macrene A合成酶用于合成β
‑
榄香烯。最近在Nostoc sp PCC 7120中鉴定了一种催化FPP电离为germacrene A的I类非植物倍半萜合酶，已被引入酿酒酵母(S.cerevisiae)中，用于germacreneA的生物合成，在摇瓶中达到190.7mg/L和309.8mg/L的产量；Chen et al.和Li et al.最近通过在大肠杆菌中表达germ acrene A合成酶，分别实现了126.4mg/L和364.26mg/Lβ
‑
榄香烯的产量。
[0004]类异戊二烯的生物合成效率涉及多种复杂的生理过程，如代谢途径的平衡表达、途径前体的积累(代谢工程)、蛋白质表达效率(翻译工程)、关键酶的活性(蛋白质工程)和细胞外转运(外排工程)。
[0005]故，了解β
‑
榄香烯生物合成的作用及其机制对于构建底盘至关重要。β
‑
榄香烯的微生物生物合成取决于细胞内前体法尼烯基焦磷酸(FPP)的可用性，该前体来源于两种通用类异戊二烯前体异戊烯基焦磷酸盐(IPP)和异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)的缩合。两个主要途径是IPP和DMAPP的供应，包括甲戊酸盐(MVA)途径和2
‑
甲基
‑
D
‑
红细胞醇4
‑
磷酸(MEP)途径。其中，外源MVA途径已被引入大肠杆菌中，以有效产生类异戊二烯。除了M VA途径的代谢工程外，改写天然中心碳代谢也是有效利用节点衍生分子的重要策略。
[0006]本专利技术提供了在类异戊二烯生产和高效细胞工厂建设中成功协调使用代谢工程、转录工程、外排工程和蛋白质工程的实例，以生产最高水平的倍半萜。

技术实现思路

[0007]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0008]鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
[0009]因此，本专利技术的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种高产β
‑
榄香烯和germacrene A的重组菌的构建方法。
[0010]为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：包括，
[0011]选择β
‑
榄香烯从头生物合成效率高的合成酶；
[0012]通过过表达酶ispA提高β
‑
榄香烯的产量；
[0013]再通过RBS工程或蛋白融合技术进一步提高β
‑
榄香烯的产量；
[0014]改写中心碳代谢途径提高前体积累；
[0015]高通量筛选定向进化酶NS，获取高活性的NS酶；
[0016]代谢调控回流积累的丙酮酸提高β
‑
榄香烯的产量；
[0017]调节外排泵促进β
‑
榄香烯的产生；
[0018]构建得到高产β
‑
榄香烯和germacrene A的重组菌。
[0019]作为本专利技术所述高产β
‑
榄香烯和germacrene A的重组菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述合成酶包括来自香椿、水稻和Nostoc sp.PCC7120的合成β
‑
榄香烯合成酶基因TS(NCBI Accession number:AB730585)，OS(NCBI Accession number:ABJ16553)和NS(NCBI Accession number:BAB76384)，序列分别如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3。
[0020]作为本专利技术所述高产β
‑
榄香烯和germacrene A的重组菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述过表达酶ispA提高β
‑
榄香烯的产量，包括，将携带过表达大肠杆菌的基因ispA的pRSF
‑
INI质粒和携带合成β
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榄香烯和germacrene A的代谢途径的质粒pA
‑
ESKKD共转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(D E3)中；
[0021]其中，所述质粒pA
‑
ESKKD的序列如SEQ ID NO：4所示。
[0022]作为本专利技术所述高产β
‑
榄香烯和germacrene A的重组菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述通过RBS工程提高β
‑
榄香烯的产量，包括，使用RBS计算器生成酶NS的电子RBS库，将这些具有500个任意单位(au)至50000au的翻译起始速率(TIR)的RBS工程序列添加到NS的5
’
端以产生质粒pR SF
‑
INI。
[0023]作为本专利技术所述高产β
‑
榄香烯和germacrene A的重组菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述通过蛋白融合技术提高β
‑
榄香烯的产量，包括，融合is pA和NS两种酶用四种不同的连接子将1类非植物合酶NS的N末端分别采用短链连接子、中链连接子、长链连接子和柔性链连接子与内源ispA的C末端融合，短链GGGS，中链(GGGS)2，长链(GGGS)3，柔性链GGGGS。
[0024]作为本专利技术所述高产β
‑
榄香烯和germacrene A的重组菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述改写中心碳代谢途径提高前体积累，包括，...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产β
‑
榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：包括，选择β
‑
榄香烯从头生物合成效率高的合成酶；通过过表达酶ispA提高β
‑
榄香烯的产量
；
再通过RBS工程或蛋白融合技术进一步提高β
‑
榄香烯的产量
；
改写中心碳代谢途径提高前体积累；高通量筛选定向进化酶NS，获取高活性的NS酶；代谢调控回流积累的丙酮酸提高β
‑
榄香烯的产量；调节外排泵促进β
‑
榄香烯的产生；构建得到高产β
‑
榄香烯和germacreneA的重组菌。2.如权利要求1所述的高产β
‑
榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：所述合成酶包括来自香椿、水稻和Nostocsp.PCC7120的合成β
‑
榄香烯合成酶基因TS(NCBIAccessionnumber:AB730585)，OS(NCBIAcce ssionnumber:ABJ16553)和NS(NCBIAccessionnumber:BAB76384)，序列分别如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3。3.如权利要求1所述的高产β
‑
榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：所述过表达酶ispA提高β
‑
榄香烯的产量，包括，将携带过表达大肠杆菌的基因ispA的pRSF
‑
INI质粒和携带合成β
‑
榄香烯和germacreneA的代谢途径的质粒pA
‑
ESKKD共转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中；其中，所述质粒pA
‑
ESKKD的序列如SEQ ID NO：4所示。4.如权利要求1所述的高产β
‑
榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：所述通过RBS工程提高β
‑
榄香烯的产量，包括，使用RBS计算器生成酶NS的电子RBS库，将这些具有500个任意单位(au)至50000au的翻译起始速率(TIR)的RBS工程序列添加到NS的5
’
端以产生质粒pRSF
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INI。5.如权利要求1所述的高产β
‑
榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：所述通过蛋白融合技术提高β
‑
榄香烯的产量，包括，融合ispA和NS两种酶用四种不同的连接子将1类非植物合酶NS的N末端分别采用短链连接子、中链连接子、长链连接子和柔性链连接子与内源ispA的C末端融合，短链GGGS，中链(GGGS)2，长链(GGGS)3，柔性链GGGGS。6.如权利要求1所述的高产β
‑
榄香烯和germacreneA的重组菌的构建方法，其特征在于：所述改写中心碳代谢途径提高前体积累，包括，基于野生菌EscherichiacoliBL21(DE3)依次敲除基因丙酮酸脱氢酶(pox B)、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(ppsA)、葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶(pt sG)、磷酸转移酶系统的葡萄糖特异性酶IIA组分(crr)、乙酰醛辅酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春立，埃里克，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：