一种类开关的去耦合-正反馈双组分基因电路响应器件制造技术

本发明专利技术公开了一种类开关的去耦合

【技术实现步骤摘要】
一种类开关的去耦合
‑
正反馈双组分基因电路响应器件


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种类开关的去耦合
‑
正反馈双组分基因电路响应器件。

技术介绍

[0002]开/关(Yes/No)装置是一种常用的电子元件，普遍存在于生活中的方方面面。计算机依赖二极管这种二进制(0/1)开关能够按照指令对各种数据和信息进行自动加工与处理以便实现复杂的功能。随着合成生物学的兴起与发展，如何利用工程学思想对细胞的基因电路进行理性的编程，使细胞的基因电路像计算机电路一样运行以使细胞实现准确和复杂的信息加工和处理功能是合成生物学家研究的热点和难点。依赖DNA元件组装的各种诱导调控表达的基因电路构成了合成生物学的底层逻辑，例如，受乳糖调控的LacI/P
lac
(转录因子/启动子)诱导表达系统和受四环素调控的TetR/P
tet
(转录因子/启动子)诱导表达系统等。基于这种基因电路的理性编程，目前已经在双稳态开关，振荡器，计数器和逻辑门等遗传装置中取得了瞩目的成果。然而，当前基因电路的开/关，依然存在开/关的状态切换不灵敏(即依赖于输入信号的剂量响应)和开/关的信号比率低(即有和无信号诱导时的输出信号的比值低)等问题。因此，使遗传编码的基因电路成为像电子元件一样的类开关(switch
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like)装置则需要挖掘更高效的调控表达系统和更灵敏的基因电路。
[0003]T.S.Gardner等(Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.Nature 403，339
‑
342，2000)通过人工合成基因线路专利技术了一种双稳态开关，该双稳态开关由两种阻遏型调控系统构成，启动子A和启动子B分别控制着阻遏蛋白B和A的表达，从而形成一个相互抑制的循环网络。由于任意一种诱导剂引发的反应不平衡，不仅会解除该阻遏蛋白对启动子的抑制，同时会降低细胞内该阻遏蛋白的密度，使得反应进一步向诱导剂诱发的方向进行，从而可以产生明显的开/关界限，形成双稳态。该类双稳态开关经多种版本演化至今仍需要两种不同的诱导剂引发来拨动开关。同时，尽管很多遗传系统通过对基因电路的合理设计能产生超灵敏的激活响应，但多数的基因电路需借助外源的激活因子，如何通过对自身基因电路进行合理的设计从而产生超灵敏的激活响应，这对于降低遗传线路的复杂性，及降低复杂基因线路对细胞代谢造成的负担具有重要意义。
[0004]双组分系统(Two
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component systems，简称TCS)，普遍存在于细菌，也存在于除动物以外的真核生物中。典型的双组分系统通常包含一个跨膜的组氨酸激酶(HK)和一个细胞内的响应调节子(RR)，它们分别执行信号的感知和启动子的转录调控等功能。通常双组分系统信号的传导始于对信号刺激(例如，金属离子铜或锌等)的感知导致的细胞内ATP对HK上一个保守的组氨酸残基的自动磷酸化，并进一步将磷酸基团转移到其同源RR上一个保守的天冬氨酸残基。在大多数情况下，磷酸化的RR(RR
P
)将形成一个二聚体，以激活其作为转录因子的功能，并通过抑制或激活启动子的转录产生生理反应。同时，许多双组分系统(例如，铜响应的CusS/CusR，锌响应的ZraS/ZraR，硝酸盐响应的NarX/NarL，渗透压响应的EnvZ/OmpR，和磷酸盐响应的PhoQ/PhoP等)的HK是一种双功能的组氨酸激酶，既能磷酸化也
能去磷酸化它的同源RR。对于磷酸化循环模块，输入是信号(包括化学配体、温度、光、渗透压等)刺激，输出是RR
P
，RR
P
由HK的磷酸化和去磷酸化循环决定，稳态下的RR
P
水平最终决定了信号输出。由于双组分系统存在磷酸化循环，之前的研究认为部分双组分系统具有鲁棒性，即对双组分系统的信号输出对RR和HK的浓度变化不敏感。
[0005]近年来，关于双组分的研究表明：对于很多双组分系统，改变RR和HK的浓度变化能显著改善双组分的信号输出。通常，增加RR的浓度将增加双组分传感系统的信号输出和泄露表达(即无诱导物时的信号输出)，增加HK的浓度(主要指HK过表达)将降低信号输出；同时相比RR，HK的浓度变化对信号输出的影响较小。因此，关于双组分的研究多通过优化RR和HK的表达水平来改善双组分传感器的诱导倍数和信号输出。然而到目前为止，未有通过对双组分系统的基因电路进行合理的设计和改造，使其能产生一种类开关的双稳态激活响应。
[0006]传统的诱导表达系统和基因电路通常是剂量响应系统，即随信号刺激的强度或诱导剂的浓度增加，其输出信号逐步增加。同时细胞内基因电路的性能往往受到各个组分表达水平的干扰，因此基于传统诱导表达系统和基因电路执行信号的加工和处理功能的可靠性和稳定性较低。而计算机之所以能准确加工和处理信息在于其双稳态的进位制(即0/1的二进制)，简化了设计并且运算规则简单，因此使基因电路获得Yes/No的类开关激活响应将促进其在细胞中执行生物逻辑计算和传感器超灵敏定性分析等功能。

技术实现思路

[0007]针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了一种类开关的去耦合
‑
正反馈双组分基因电路响应器件，使该基因电路具有Yes/No的类开关激活效应。
[0008]一种类开关的去耦合
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正反馈双组分基因电路响应器件，包括：
[0009]去耦合表达模块，用于由单独的组成型启动子驱动表达组氨酸激酶，所述组氨酸激酶用于感知外界信号刺激；
[0010]正反馈表达模块，用于由响应调节子的同源启动子同时驱动表达响应调节子和报告基因，所述响应调节子用于执行转录激活功能，所述报告基因用于执行信号输出。
[0011]优选的，所述正反馈表达模块中，报告基因位于响应调节子的上游。这样在同源启动子同时驱动表达响应调节子和报告基因时，可以确保只有在报告基因顺利表达时，响应调节子才能表达。报告基因和响应调节子分别使用不同活性的核糖体结合位点，这样在同源启动子同时驱动表达响应调节子和报告基因时，可以确保响应调节子的表达量除受转录水平控制外还可以由不同的翻译水平调控。
[0012]使用低活性的核糖体结合位点用于响应调节子的翻译，比如，所述核糖体结合位点可以为r107、r33或r101。如果使用活性过高的核糖体结合位点，则响应调节子在没有诱导剂的情况下可能不能完全关闭，而有泄漏表达。
[0013]报告基因的核糖体结合位点没有特别要求，可以使用比如r30核糖体结合位点。
[0014]所述组成型启动子为低活性的组成型启动子，比如P
J109
或P
J117
。
[0015]优选的，所述组氨酸激酶为锌响应的ZraS，所述响应调节子为ZraR，响应调节子的同源启动子为P
zraP
。本申请中类开关的去耦合
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种类开关的去耦合
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正反馈双组分基因电路响应器件，其特征在于，包括：去耦合表达模块，用于由单独的组成型启动子驱动表达组氨酸激酶，所述组氨酸激酶用于感知外界信号刺激；正反馈表达模块，用于由响应调节子的同源启动子同时驱动表达响应调节子和报告基因，所述响应调节子用于执行转录激活功能，所述报告基因用于执行信号输出。2.根据权利要求1所述类开关的去耦合
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正反馈双组分基因电路响应器件，其特征在于，所述正反馈表达模块中，报告基因位于响应调节子的上游。3.根据权利要求1所述类开关的去耦合
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正反馈双组分基因电路响应器件，其特征在于，使用低活性的核糖体结合位点用于响应调节子的翻译。4.根据权利要求3所述类开关的去耦合
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正反馈双组分基因电路响应器件，其特征在于，所述核糖体结合位点为r107、r33或r101。5.根据权利要求1所述类开关的去耦合
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正反馈双组分基因电路响应器件，其特征在于，所述组成型启动子为低活性的组成型启动子P
J109
或P
J117
。6.根据权利要求1所述类开关的去耦合
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正反馈双组分基因电路响应器件，其特征在于，所述组氨酸激酶为锌响应的ZraS，所述响应调节子为Z...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宝俊，周楠，陈升言，
申请(专利权)人：浙江大学杭州国际科创中心，
类型：发明
国别省市：