一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法。本发明专利技术方法先以一条半重复单位单链起始引物引导重组质粒的起始PCR扩增，再以一对双拷贝互补引物对引导重组质粒的后续PCR扩增。本发明专利技术方法成功地在重组质粒的GPLD1及INPP4B基因上生成了短片段串联重复序列。本发明专利技术方法实施简便、无需复杂的克隆操作，阳性克隆比率高。所生成的串联重复序列具有如下特征：(1)重复单位方向一致、拷贝数可变。(2)重复单位连接区之间不存在碱基突变，不改变编码基因阅读框。本发明专利技术方法适合在重组质粒上的任意编码基因上生成短片段串联重复序列，为阐明串联重复序列与细胞衰老、肿瘤发生及多种神经退行性疾病的发病关系提供了新型研究工具。的发病关系提供了新型研究工具。

【技术实现步骤摘要】
一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法


[0001]本专利技术涉及一种先以一条半重复单位单链起始引物引导重组质粒的起始PCR扩增，再以一对双拷贝互补引物对引导重组质粒的后续PCR扩增，以重组质粒上编码基因的20
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100bp片段为重复单位，体外生成短片段串联重复序列的方法，属于生物


技术介绍

[0002]在人类基因组中重复序列约占50％以上，并分散于整个基因组中。重复序列可分为串联重复序列、分散重复序列两大类。根据串联重复序列的重复单位长度又可分为：微卫星DNA(microsatellite DNA)、小卫星DNA(minisatellite DNA)。小卫星DNA的重复单位长度为几十至几百bp、重复次数通常为几十到数百。因此又称为拷贝数可变的短片段串联重复序列。小卫星DNA在人群中因为重复次数不同而呈现高度多态性，其在生命科学和医学领域中有着愈来愈重要的作用。
[0003]短片段串联重复序列在维护人类基因组的稳定性及一些遗传病的发生上具有重要作用。人类染色体端粒DNA序列由5
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TTAGGG
‑3’
高度重复组成，对于保护染色体以及控制细胞生长具有重要意义。在肿瘤细胞中端粒长度明显缩短、端粒酶活性明显升高，说明端粒的长度与肿瘤的发生有相关性。三核苷酸重复是生物体内常见的重复序列，其拷贝数目变化与多种神经肌肉和神经退行性疾病有关。如亨廷顿舞蹈症病人中，其致病基因IT15的CAG三核苷酸重复序列拷贝数增高会导致该病发病年龄提前、病情加重。其他常见疾病还有肌强制性营养不良、脆性X染色体综合征，其发病机制均与三核苷酸重复序列的拷贝数增多相关。研究推测在编码区重复序列会导致编码蛋白呈现细胞毒性或免疫原性，在非编码区出现的重复序列会导致编码区转录和翻译异常。因此在体外建立重复序列创建模型，阐明DNA重复序列发生机制是揭示上述神经退行性疾病发病机理的重要途径，并且为开发相关治疗药物提供理论基础。
[0004]目前认为，体内的串联重复序列产生机制主要有滑动复制、滚环复制及端粒复制三种生成模型。(1)复制滑动机制是目前研究比较多的短片段串联重复序列产生机制。在DNA复制过程中，滑动复制滞后链的复制会先形成冈崎片段，缺口再连接。经历DNA聚合酶的去组装与再组装。期间新合成的DNA链与模板链会随DNA聚合酶脱离，此时模板链或滞后链形成一个loop环，就会导致短片段串联重复序列拷贝数的减少或增加。但是该复制模型不能解释短片段串联重复序列在基因组中连续出现、大量扩增的现象及短片段串联重复序列连接区之间存在基因突变。(2)滚环复制是噬菌体DNA、部分质粒DNA的复制方式，其可以在短时间内大量扩增DNA，供生物体利用。但该机制是建立在噬菌体和质粒DNA整体复制的基础上，不能完美解释基因组局部小片段DNA复制的过程。(3)染色体端粒的爬行复制机制是目前研究比较清楚的串联重复序列生成机制。然而端粒复制是独特的复制机制，需要端粒酶活性及短RNA为复制模板。
[0005]鉴于重复序列在维护基因组稳定性及神经性退行性疾病中的重要作用，人们一直
在研发体外生成串联重复序列，特别是短片段串联重复序列的体外生成方法。目前比较成熟的方法有无模板PCR扩增和长迭代核苷酸合成(简称SLIP)。(1)无模板PCR法应用一对互补片段作为重复单位，由于互补片段可以形成错位互补，因此在每个PCR循环后均有可能延长重复片段的长度，该方法后续需要复杂的克隆及亚克隆基因操作，才能获得所需要的短片段重复序列。(2)SLIP虽然是在质粒上合成短片段串联重复序列，但是需要重复序列两端均含有不同的限制性内切酶位点，重组质粒通过两种限制性内切酶分别酶切，酶切产物混合并退火，可能形成有错位互补的质粒，再以DNA聚合酶填补缺口区域导致重复序列增加长度，再转化感受态大肠杆菌，提取转化质粒即可获得重复片段延长的质粒。为增加重复单位长度，每个重复单位延长循环均需要重复上述步骤。因此，该方法虽然不需要基因克隆操作，但生成方法十分繁琐，费时费力。
[0006]鉴于上述体外生成短片段串联重复序列方法均存在较大缺陷，本专利技术建立了双拷贝互补引物对引导法，该方法通过体外扩增重组质粒，制备短片段串联重复序列。本方法的关键在于先以一条半重复单位单链起始引物引导，进行重组质粒的起始PCR扩增，再以一对双拷贝互补引物对引导，进行重组质粒的后续PCR扩增。本方法实施简便、无需复杂的克隆及亚克隆操作。生成短片段的质粒克隆阳性率高(约40％)。所生成的重复序列具有如下特征：(1)重复单位方向一致、拷贝数可变。(2)重复单位连接区之间不存在碱基突变，适合编码基因中重复序列的创建。(3)本方法适合于克隆于质粒上任意编码基因的20
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100bp的短片段串联重复序列创建，为阐明重复序列与细胞衰老、肿瘤发生及神经退行性疾病的发病关系和开发相关治疗提供新型研究工具。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0009]本专利技术的一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法，其包括以下步骤：
[0010](1)构建含有目的编码基因的重组质粒，作为体外PCR扩增的起始模板；
[0011](2)先以一条半重复单位单链起始引物引导重组质粒的起始PCR扩增，然后以起始PCR扩增产物为模板通过一对双拷贝互补引物对进行后续PCR扩增，其中，所述的短片段，即重复单位，长度为20
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100bp，所述的双拷贝互补引物对中的正向和反向引物分别含有两拷贝的短片段重复单位，所述的半重复单位单链起始引物为一条起始于该短片段正向序列中部，终止于该短片段正向序列3
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末端的单链引物；
[0012](3)使用限制性内切酶DpnI对PCR产物进行酶切，去除起始重组质粒模板；
[0013](4)酶切产物转化大肠杆菌感受态细胞；
[0014](5)菌落接种培养基，进行扩大培养；
[0015](6)菌液PCR鉴定以及Sanger法DNA测序。
[0016]其中，优选的，所述的重组质粒为含有任意编码基因的pcDNA3.1(
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)。
[0017]其中，优选的，所述的双拷贝互补引物对中含有的两拷贝的短片段重复单位为野生型序列或者为含有突变位点的序列。
[0018]其中，优选的，所述的编码基因为与神经性退行性疾病相关的致病基因。
[0019]其中，优选的，所述的神经性退行性疾病包括亨廷顿舞蹈症、强直性肌营养不良以及脆性X染色体综合征。
[0020]在本专利技术的一个具体实施例中，为了研究磷脂酶GPLD1在抗衰老方面的作用，我们以重组质粒pcDNA3.1(
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)
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GPLD1为基础，对其上编码基因GPLD1的磷脂酶活性区3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过体外扩增重组质粒在其编码基因上生成短片段串联重复序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)构建含有目的编码基因的重组质粒，作为体外PCR扩增的起始模板；(2)先以一条半重复单位单链起始引物引导重组质粒的起始PCR扩增，然后以起始PCR扩增产物为模板通过一对双拷贝互补引物对进行后续PCR扩增，其中，所述的短片段，即重复单位，长度为20
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100bp，所述的双拷贝互补引物对中的正向和反向引物分别含有两拷贝的短片段重复单位，所述的半重复单位单链起始引物为一条起始于该短片段正向序列中部，终止于该短片段正向序列3
’
末端的单链引物；(3)使用限制性内切酶DpnI对PCR产物进行酶切，去除起始重组质粒模板；(4)酶切产物转化大肠杆菌感受态细胞；(5)菌落接种培养基，进行扩大培养；(6)菌液PCR鉴定以及Sanger法DNA测序。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组质粒为含有任意编码基因的pcDNA3.1(
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)。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的编码基因为与神经性退行性疾病相关的致病基因。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的双拷贝互补引物对中含有的两拷贝的短片段重复单位为野生型序列或者为含有突变位点的序列。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的神经性退行性疾病包括亨廷顿舞蹈症、强直性肌营养不良以及脆性X染色体综合征。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的短片段串联重复序列为抗衰老基因GPLD1磷脂酶活性区31bp短片段串联重复序列，所述的方法包括以下步骤：(1)构建含有目的编码基因的重组质粒；将抗衰老基因GPLD1克隆到pcDNA3.1(
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)载体中，得到重组质粒pcDNA3.1(
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)
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GPLD1，作为体外PCR扩增的起始模板；(2)DF
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62与DR
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62是以GPLD1磷脂酶活性区31bp短片段为模板设计的完全互补引物，分别含有两拷贝31bp短片段重复单位，为了方便后续测序鉴定，将DF
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62中GGA突变为AAA，DR
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62中的TCC突变为TTT，Short
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15是一条起始于该短片段正向序列中部，终止于该短片段正向序列3
’
末端的长度为15bp的半重复单位单链起始引物，与野生型相比，半重复单位单链起始引物Short
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15存在AA两个突变位点，以便于测序结果分析，Se...

【专利技术属性】
技术研发人员：周春水，林国超，胡子琪，章铭珠，朴晟文，范建坤，柳继超，刘鹏，傅松滨，孙文静，邱晓红，张金伟，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：