一种毕赤酵母突变菌株及其在溶菌酶生产中的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母突变菌株及其在溶菌酶生产中的应用。所述突变菌毕赤酵母RONG2

【技术实现步骤摘要】
一种毕赤酵母突变菌株及其在溶菌酶生产中的应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种毕赤酵母突变菌株及其在溶菌酶生产中的应用。

技术介绍

[0002]溶菌酶(Lysozyme)是一种能水解致病菌中黏多糖的水解酶，它是一种碱性酶，又称为胞壁质酶(muramidase)或N
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乙酰胞壁质聚糖水解酶(N
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acetylmuramide glycanohydrlase)，主要通过破坏细胞壁中的N
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乙酰胞壁酸和N
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乙酰氨基葡糖之间的β
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1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等重要作用。
[0003]1992年FAO/WTO的食品添加剂协会公布:溶菌酶应用于食品工业中是安全的，我国卫生部2010年第23号公告批准溶菌酶等物质为食品添加剂。溶菌酶的化学本质为蛋白质，在人及动物的胃肠内可以被消化、吸收，因此不会在体内残留且安全性很高，在食品、药品和饲料等行业具有广泛的应用前景。它在食品工业中可当作天然防腐剂，可延长肉制品、水产品、乳制品、果蔬等的储存时间；在药品领域具有抗病毒、抗感染、调节肠道菌群、止血及凝血等作用；在动物饲料工业上能提高动物的生产性能、调整动物肠道菌群、减少并替代抗生素的使用，是新型的环保饲料添加剂，同时也可以作为饲料防腐剂和杀菌剂，具有安全无毒等优点。
[0004]溶菌酶在自然界中来源广泛，根据来源不同可分为动物溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶，其中动物溶菌酶又分为鸡型溶菌酶(c型溶菌酶)、鹅型(g型)溶菌酶、无脊椎型溶菌酶三种。目前溶菌酶主要从鸡蛋清和蛋壳膜中提取。但这种 直接提取的生产方式，其规模小、成本高，不利于大规模化生产与应用。同时蛋清溶菌酶热稳定性差和对变性剂的难受性较差，其作为饲料添加剂时，饲料造粒过程中有高温处理步骤，由于蛋清溶菌酶不耐受高温，活力受损，严重限制了其应用。特别是近年来，随着饲料用的抗生素的管理不断加强，溶菌酶的市场需求正快速扩大，利用基因工程技术构建溶菌酶酵母表达系统，可对溶菌酶进行异源表达和微生物发酵生产，已成为溶菌酶生产技术研究的热点。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供了一种毕赤酵母突变菌株及其在溶菌酶生产中的应用。所述突变菌株是通过紫外诱变的方法筛选获得的，溶菌酶产量得到显著提高，有利于降低该酶的生产成本，促进其广泛应用。
[0006]本专利技术一方面涉及一种重组质粒，其携带有溶菌酶基因。
[0007]所述溶菌酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
[0008]本专利技术一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有上述重组质粒。
[0009]本专利技术还涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。
[0010]所述突变菌株为毕赤酵母RONG2
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5（Pichia pastoris RONG2
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5），已于2022年6月27日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022976。
[0011]本专利技术还涉及一种发酵生产溶菌酶的方法，是以上述毕赤酵母突变菌为发酵菌株。
[0012]有益效果本专利技术首先构建得到重组表达溶菌酶基因的工程菌毕赤酵母RONG2，其摇瓶发酵上清液中溶菌酶酶活最高达到6544U/ml；然后以毕赤酵母RONG2为出发菌，通过紫外诱变筛选获得突变菌株毕赤酵母RONG2
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5，能大幅度提高溶菌酶的表达量，其摇瓶发酵上清液中溶菌酶酶活高达10221U/ml，比出发菌提高了56.2%，取得了意料不到的技术效果。
[0013]所述突变菌株可作为溶菌酶的发酵生产菌株，有利于降低该酶的生产成本，促进其在饲料领域中的广泛应用。
具体实施方式
[0014]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。
[0015]下面结合具体实施方式，对本专利技术做进一步阐述。
[0016]实施例1 溶菌酶基因的克隆申请人以来源于Gallus gallus的溶菌酶基因（GenBank号为NP_990612.2）序列为基础，分析该酶的氨基酸序列，去除其自身的信号肽，再根据毕赤酵母的密码子偏好性，对其进行密码子优化，由华大基因公司进行全基因合成。将该溶菌酶基因命名为RONG2，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
[0017]采用PCR反应克隆溶菌酶RONG2的基因片段，引物序列和反应条件如下：引物1(F)：gcgcgaattcaaggtcttcggccgatgcgagctgg（下划线为EcoR I的酶切位点）；引物1(R)：taaagcggccgcttagaggcggcagcctcgaatccaa（下划线为Not I的酶切位点）。
[0018]PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸40s，35个循环后，72℃保温10min。RONG2基因全长390bp。
[0019]实施例2毕赤酵母工程菌的构建1、重组质粒的构建将克隆得到的溶菌酶RONG2基因，用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，100 μl酶切体系如下：溶菌酶基因RONG2的PCR产物40 μl、10
×
H buffer 10 μl、10
×
BSA 10 μ
l、EcoR I 5 μl、Not I 5 μl、ddH2O 30 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
[0020]将表达载体pPIC9K先用限制性内切酶EcoR I进行单酶切，100 μl酶切体系如下：表达载体pPIC9K 20 μl、10
×
H buffer 10 μl、EcoR I 5 μl、ddH2O 65 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶Not I进行单酶切，100 μl酶切体系如下：pPIC9K回收片段 20 μl、10
×
H buffer 10 μl、10
×
BSA 10 μl、10
×...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有溶菌酶基因。2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述溶菌酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。3.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌携带有权利要求1或2所述的重组质粒。4.一种毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述的突变菌是以权利要求3所述的毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。5.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：程斯达，鲍锴，康丽华，张静静，刘文瑶，葛菁华，
申请(专利权)人：潍坊康地恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：