一种产生对萜类或含萜精油的耐受性提高的重组宿主细胞的方法及其用途技术

本发明专利技术涉及基因工程领域。具体地，本发明专利技术涉及对萜类或含萜精油耐受性提高或萜类产量提高的重组宿主细胞、其产生方法及其用途。更具体地，所述重组宿主细胞通过增加野生型宿主细胞中PDR5蛋白的表达量或活性而产生，其可用于萜类生产。于萜类生产。

【技术实现步骤摘要】
一种产生对萜类或含萜精油的耐受性提高的重组宿主细胞的方法及其用途
[0001]本申请是2016年11月23日提交的题为“对萜类或含萜精油耐受性提高或萜类产量提高的重组宿主细胞、其产生方法及其用途”的中国专利申请201611037629.9的分案申请。


[0002]本专利技术涉及基因工程领域。具体地，本专利技术涉及对萜类或含萜精油耐受性提高或萜类产量提高的重组宿主细胞、其产生方法及其用途。

技术介绍

[0003]天然活性产物一般为生物体生物合成的微量次生代谢物，在生物体内主要发挥信号传导、化感、阻止病菌和昆虫入侵等作用。同时由于其重要的生物学活性，已被广泛地应用于医疗保健和营养等领域。从原植物中直接提取是目前生产这类天然产物的主要方式，但这种方法有较多的缺点，包括含量低和差异大，产品纯化难，植物生长周期长，对生物资源尤其野生资源造成严重破坏等。
[0004]目前利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在酵母工程菌中生产青蒿素的前体青蒿酸最高达到25g/L(Paddon CJ et al.,2013,Nature,2013,496:528
‑
532)。然而许多天然产物对微生物宿主有毒性，将严重影响其在细胞工厂中的生产效率。因此，挖掘能提高微生物宿主对该天然产物具有耐受性的功能蛋白是高效细胞工厂创建成功的关键。
[0005]水解ATP供能的ABC转运蛋白(ATP
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binding cassette transporter)和依赖于H
+
/Na
+
浓度梯度的逆向转运的MATE解毒蛋白(Multidrug and toxic compound extrusion transporter)等转运蛋白是执行该功能的主要蛋白。例如，在植物药黄连素的转运研究中，科学家发现了MATE类外排蛋白AtDTX1能向细胞外转运黄连素，并在酿酒酵母中过表达AtDTX1蛋白能显著提高细胞对抗黄连素的毒性(Li L et al.,J Biol Chem 2002,277(7):5360
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5368.)。
[0006]青蒿素、紫杉醇、β
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榄香烯、莪术油、吉马烯A等萜类化合物在肿瘤和感染等方面有广泛临床应用。然而，许多重要的萜类化合物对微生物宿主均有毒性。针对数量众多的萜类化合物，尤其是一些重要的萜类化合物，有必要挖掘能提高宿主细胞对其具有耐受性的特定功能蛋白，从而为这类化合物的高效生物合成奠定基础。
[0007]专利技术概述
[0008]本专利技术提供了对萜类或含萜精油耐受性提高或萜类产量提高的宿主细胞及其用途，具体技术方案如下：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种重组宿主细胞，其包含与对应野生型宿主细胞相比表达量或活性增加的PDR5蛋白。
[0010]第二方面，本专利技术提供了一种产生对萜类或含萜精油的耐受性提高或萜类产量提高的重组宿主细胞的方法，其包括增加野生型宿主细胞中PDR5蛋白的表达量或活性的步
骤。
[0011]在本专利技术的具体实施方案中，PDR5蛋白的表达量增加通过增加PDR5基因的拷贝数和/或使用强启动子实现。
[0012]在与增加PDR5基因的拷贝数有关的一个具体实施方案中，PDR5基因是酿酒酵母PDR5基因。
[0013]在与增加PDR5基因的拷贝数有关的进一步的具体实施方案中，酿酒酵母PDR5基因由SEQ ID NO：1的核酸序列组成。
[0014]第三方面，本专利技术提供了分离的编码PDR5蛋白的多核苷酸用于提高宿主细胞对萜类或含萜精油的耐受性或提高宿主细胞萜类产量的用途。
[0015]在一个具体实施方案中，编码PDR5蛋白的多核苷酸是酿酒酵母PDR5基因。
[0016]在进一步的实施方案中，酿酒酵母PDR5基因由SEQ ID NO：1的核酸序列组成。
[0017]第四方面，本专利技术提供了PDR5蛋白用于提高宿主细胞对萜类或含萜精油的耐受性或提高宿主细胞萜类产量的用途。
[0018]在一个具体实施方案中，PDR5蛋白是酿酒酵母PDR5蛋白。
[0019]在一个具体实施方案中，酿酒酵母PDR5蛋白由SEQ ID NO：139的氨基酸序列组成。
[0020]在本专利技术的上述各方面中，宿主细胞进一步包含用于萜类生产的外源多核苷酸。
[0021]在本专利技术的上述各方面中，宿主细胞是真核生物，优选酵母纲(Saccharomycetes)。
[0022]在本专利技术的上述各方面中，宿主细胞选自伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、念珠菌属(Candida)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希菌属(Escherichia)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyce)、硫磺菌属(Laetiporus)、香菇属(Lentinus)、红发夫酵母属(Phaffia)、平革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)、藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢属(Sphaceloma)、红发夫酵母属(Xanthophyllomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia genera)。
[0023]在本专利技术的上述各方面中，宿主细胞选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、博伊丁念珠菌(Candida boidinii)、Arxula adeninivorans、红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)或白色念珠菌(Candida albicans)物种，优选酿酒酵母。
[0024]在本专利技术的上述各方面中，萜类选自半萜、单萜、倍半萜和二萜，优选选自单萜和倍半萜，尤其优选倍半萜。
[0025]在本专利技术的上述各方面中，萜类选自香叶酯、香叶醇、金合欢醇、橙花叔醇、诺卡酮、吉玛烯A、榄香烯、檀香醇、香紫苏醇，优选选自金合欢醇、橙花叔醇、吉玛烯A、榄香烯和檀香醇，含萜精油选自莪术油、姜黄油、甜橙油、薄荷油、紫苏油和檀香油，优选选自莪术油、姜黄油和檀香油。
[0026]第五方面，本专利技术提供了一种生产萜类的方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产生对萜类或含萜精油的耐受性提高的重组宿主细胞的方法，其包括增加野生型宿主细胞中PDR5蛋白的表达量或活性的步骤，其中所述萜类或含萜精油选自香叶醇、金合欢醇、橙花叔醇、诺卡酮、吉玛烯A、榄香烯、檀香醇、香紫苏醇、莪术油、姜黄油、甜橙油、薄荷油、紫苏油和檀香油，优选选自金合欢醇、橙花叔醇、吉玛烯A、榄香烯、檀香醇、莪术油、姜黄油和檀香油。2.权利要求1的方法，其中PDR5蛋白的表达量增加通过增加PDR5基因的拷贝数和/或使用强启动子实现，优选所述PDR5基因是酿酒酵母PDR5基因，更优选所述酿酒酵母PDR5基因由SEQ ID NO：1的核酸序列组成。3.权利要求1的方法，其中：(a)所述宿主细胞进一步包含用于萜类生产的外源多核苷酸；和/或(b)所述宿主细胞是真核生物，优选酵母纲(Saccharomycetes)。4.权利要求1的方法，其中所述宿主细胞选自伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、念珠菌属(Candida)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希菌属(Escherichia)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyce)、硫磺菌属(Laetiporus)、香菇属(Lentinus)、红发夫酵母属(Phaffia)、平革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)、藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢属(Sphaceloma)、红发夫酵母属(Xanthophyllomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia genera)，更优选所述宿主细胞选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，戴住波，张丽丽，王冬，刘芸，马晓琳，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：