盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌及其构建方法与应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过对具有耐盐性的鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii 3792)克隆脂肪酸合成前体，控制乙酰辅酶A合成的关键基因(ACSS)，通过连接到能在酿酒酵母中高拷贝双向表达质粒pY15TEF

【技术实现步骤摘要】
盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体而言，涉及一种盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]微生物在发酵和生长过程中容易受到各种环境的干扰，包括外源环境和内源环境。
[0003]鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)是耐高渗透压的酵母菌，它能在含糖量很高含盐量很高的物料中生长，甚至在饱和食盐条件下仍不能完全抑制它的生长。鲁氏酵母菌是酿制酱油、酱的重要菌种，它能赋予产品乙醇、酯类、糠醛、琥珀酸、呋喃酮等香气成分。因此其被广泛使用于豆瓣、酱油、味噌等传统高盐发酵食品的生产过程中。
[0004]酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)是重要的工业模式菌株，广泛应用于酒类食品的生产中。然而，不利的酿造环境因素，例如盐胁迫等胁迫条件，往往使酿酒酵母难以维持高强度的发酵生产。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌及其构建方法与应用，通过在酿酒酵母菌中过表达乙酰辅酶A合成酶基因(ACSS)，可以提高脂肪酸合成能力，进而增强酿酒酵母菌的盐胁迫抗性。
[0007]为实现上述目的，本专利技术构建一种盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌。本专利技术首先将包含有鲁氏酵母菌(Zygosaccharomyces rouxii)的乙酰辅酶A合成酶基因的载体导入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，发现导入包含乙酰辅酶A合成酶基因的载体的重组菌的脂肪酸合成能力得到提高，进而增强重组菌的盐胁迫耐受能力。
[0008]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌，该重组菌中含有外源基因；外源基因包括乙酰辅酶A合成酶基因。
[0010]第二方面，本专利技术提供了上述重组酿酒酵母菌的构建方法，其包括：将乙酰辅酶A合成酶基因连接到表达质粒上，然后将该重组表达质粒导入至酿酒酵母菌中，即获得重组酿酒酵母菌。
[0011]第三方面，本专利技术提供了上述重组酿酒酵母菌在发酵酿造和发酵食品领域中的应用。
[0012]第四方面，本专利技术提供了一种增强酿酒酵母菌盐胁迫抗性的方法，其包括利用上述重组酿酒酵母菌过表达乙酰辅酶A合成酶基因，以控制脂肪酸合成。
[0013]本专利技术具有以下有益效果：
[0014]本专利技术通过克隆表达鲁氏酵母菌ACSS基因，并将其导入酿酒酵母菌中，诱导乙酰
辅酶A合成酶基因表达，增强了酿酒酵母脂肪酸的合成能力以及盐胁迫耐受能力。结果表明，在过表达ACSS后，与未过表达菌株相比，脂肪酸总量提高了18.4％，在盐胁迫条件下过表达ACSS菌株的活菌数提高了52.17％。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0016]图1为实施例1、对比例1的脂肪酸总量结果。
[0017]图2为实施例1、对比例1的活菌数统计结果。
具体实施方式
[0018]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0019]本专利技术提供了一种盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌，该重组菌中含有外源基因；外源基因包括乙酰辅酶A合成酶基因。
[0020]目前，乙酰辅酶A是能源物质代谢的重要中间代谢产物，在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路——三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用以ATP的合成。乙酰辅酶A是合成脂肪酸、酮体等能源物质的前体物质，也是合成胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。
[0021]本专利技术通过创造性研究发现，乙酰辅酶A不仅在能源物质代谢中起到关键作用，还发现其能够调节生物体对不利环境的耐受能力。基于此，本专利技术的专利技术人将包含有鲁氏酵母菌的乙酰辅酶A合成酶基因的载体导入酿酒酵母中，并诱导乙酰辅酶A的合成，试验结果表明构建的重组菌的脂肪酸合成能力得到提高，进而使更能克服发酵生产中不利的环境因素，特别是盐胁迫环境。
[0022]在一些实施方式中，乙酰辅酶A合成酶基因来源于鲁氏酵母菌。
[0023]鲁氏酵母菌是耐高渗透压的酵母菌，它能在含糖量很高含盐量很高的物料中生长，甚至在饱和食盐条件下仍不能完全抑制它的生长。鲁氏酵母菌是酿制酱油、酱的重要菌种，它能赋予产品乙醇、酯类、糠醛、琥珀酸、呋喃酮等香气成分。因此其被广泛使用于豆瓣、酱油、味噌等传统高盐发酵食品的生产过程中。
[0024]在一些实施方式中，上述鲁氏酵母菌(Z.rouxii)选用的是保藏编号为CGMCC No.3791的鲁氏酵母菌，其保藏时间为2010年4月29日，保藏地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0025]在一些实施方式中，乙酰辅酶A合成酶基因的NCBI gene ID为ZYGR_0I00290。
[0026]在一些实施方式中，乙酰辅酶A合成酶基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.1。
[0027]在一些实施方式中，重组酿酒酵母菌的出发菌株为酿酒酵母菌CEN.PK2
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1C，公开于van Di jken JP et al.,Enzyme Microb.Technol.2000,26:706
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714中，基因型为MATa ura3
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52 leu3
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5,112trp1
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289his3ΔMAL2
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8 c SUC2，由江南大学惠赠。
[0028]在一些实施方式中，上述重组酿酒酵母菌的表达质粒为高拷贝双向表达质粒。
[0029]在一些实施方式中，上述表达质粒包括pY15TEF
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1(Biovector Co.,LTD)，其带有亮氨酸LEU标记，由江南大学惠赠。
[0030]本专利技术还提供了上述重组酿酒酵母菌的构建方法，其包括：将乙酰辅酶A合成酶基因连接到表达质粒上，然后将该重组表达质粒导入至酿酒酵母菌中，即获得重组酿酒酵母菌。
[0031]具体地，构建方法包括如下步骤：
[0032](1)将两端分别带有Hind III和Xho I两个酶切位点及保护碱基的目的基因ACSS，连接到经过同样酶切的pY15TEF1，转化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种盐胁迫抗性增强的重组酿酒酵母菌，其特征在于，所述重组酿酒酵母菌中含有外源基因；所述外源基因包括乙酰辅酶A合成酶基因。2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A合成酶基因来源于鲁氏酵母菌；优选地，所述鲁氏酵母菌的保藏编号为CGMCC No.3791；优选地，所述乙酰辅酶A合成酶基因的NCBI gene ID为ZYGR_0I00290；优选地，所述乙酰辅酶A合成酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。3.根据权利要求2所述的重组酿酒酵母菌，其特征在于，所述重组酿酒酵母菌的出发菌株为酿酒酵母菌CEN.PK2
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1C，其基因型为MATa ura3
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52leu3
‑
5,112trp1
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289 his3ΔMAL2
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8 c SUC2。4.根据权利要求3所述的重组酿酒酵母菌，其特征在于，所述重组酿酒酵母菌含有高拷贝双向表达质粒；优选地，所述表达质粒包括pY15TEF
‑
1。5.如权利要求1
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4任一项所述的重组酿酒酵母菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将所述乙酰辅酶A合成酶基因连接到所述表达质粒上，然后将该重组表达质粒导入至酿酒酵母菌中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴重德，王定康，金垚，黄钧，周荣清，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：