一种重组酵母生物转化生产葡萄糖及其衍生物的方法技术

一种重组酵母生物转化生产葡萄糖及其衍生物的方法，属于合成生物学技术领域。本发明专利技术构建方法包括以下任一项：

【技术实现步骤摘要】
一种重组酵母生物转化生产葡萄糖及其衍生物的方法


[0001]本专利技术属于合成生物学
，具体涉及一种一种重组酵母生物转化生产葡萄糖及其衍生物的方法。

技术介绍

[0002]葡萄糖，化学式为C6H
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O6，是自然界分布最广、最重要的一种己糖。葡萄糖作为重要的食品、化工原料，在食品、发酵和医药等领域有着广泛的利用。目前，葡萄糖制备主要以玉米、薯类等粮食作物提取而来的淀粉为原料，主要生产工艺有：酸法、酸酶法和双酶法，其中双酶法是目前最为理想、运用最广的制糖方法。淀粉经糊化、液化、糖化等步骤，水解形成葡萄糖，生产工艺复杂、能耗较大、且消耗大量粮食作物。我国是人口大国，截至2020年，全国人口已达14亿，占全球人口20％。但是总耕地面积仅占全球7％，人均耕地面积不足世界人均耕地面积的四成，耕地生产能力已近极限，且粮食生产过程中时间周期长，容易受地域，气候，战争的因素的影响，粮食危机日趋严重。因此，急需开发一种新的生产葡萄糖的方法，以有效避免以上问题，实现大规模，快速的制备食品原料葡萄糖。
[0003]除了葡萄糖，本专利技术进一步扩大了糖衍生物的化学空间，生产单糖衍生物
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肌醇、氨基葡萄糖、多糖衍生物(蔗糖)。
[0004]肌醇对健康至关重要，其补充剂已被证明可以改善代谢性能，是治疗多种疾病的有价值的替代品。目前，肌醇的生产方式主要包括水解法和化学合成法，但都存在产率低，能耗高，污染严重等问题。
[0005]氨基葡萄糖具有多种特定的生物活性，在食品、化妆品和生物医药行业有着广泛的应用。氨基葡萄糖生产方式主要包括酸解法、酶解法和微生物发酵法，前两种由于生产效率低和环境污染等因素，将逐渐被淘汰。
[0006]寡糖和多糖在营养中起主要作用，是生物体的结构成分。蔗糖是一种众所周知的低聚糖，广泛应用于食品、医药和大宗化工等行业。目前，蔗糖的主要来源是从热带地区的甘蔗和温带地区的甜菜中提取。多糖淀粉是食物能源的主要来源，同时其在造纸和生物可降解材料的合成中有着广泛的应用。之前，农业种植是生产淀粉的唯一方式。最近，基于化学
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生化混合方法在无细胞系统中使用CO2为碳源，实现了体外淀粉的合成。因此，基于电化学转化CO2获得的低碳化合物为碳源，通过微生物细胞工厂生产葡萄糖及糖衍生物，不仅实现了CO2的有效利用，也将为粮食供给提供新策略。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种重组酵母菌株的构建方法。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供一种重组酵母菌株生产葡萄糖及其衍生物及菌株。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供一种高产葡萄糖及其衍生物的重组酿酒酵母菌株。
[0010]本专利技术的另一目的在于提供一种生产和高产葡萄糖及其衍生物菌株在转化非粮低碳碳源的应用。
[0011]在第一方面，本专利技术提供一种重组酵母生产葡萄糖及其衍生物菌株的构建方法，其特征在于包括以下任一构建方法：
[0012]ⅰ
、敲除酵母菌株中葡萄糖及其衍生物代谢途径相关酶；
[0013]ⅱ
、增强或利用酵母菌株自身葡萄糖及其衍生物合成途径相关酶活性；
[0014]ⅲ
、增强或利用酵母菌株自身葡萄糖及其衍生物出入酵母能力；
[0015]优选所述酵母菌株包括酿酒酵母、甲醇酵母、产油酵母；更优选酿酒酵母及甲醇酵母。
[0016]所述的构建方法中，所述葡萄糖代谢途径相关酶包括葡萄糖激酶和相关己糖激酶的同工酶；所述葡萄糖衍生物中蔗糖的代谢途径相关酶包括蔗糖酶、麦芽糖酶和异麦芽糖酶；
[0017]所述葡萄糖合成途径相关酶包括葡萄糖磷酸酶，优选葡萄糖磷酸酶包括葡萄糖
‑1‑
磷酸酶、葡萄糖
‑6‑
磷酸酶；所述葡萄糖衍生物中氨基葡糖的合成途径相关酶包括氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸磷酸酶和氨基葡萄糖
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磷酸脱氨酶；所述葡萄糖衍生物中蔗糖的合成代谢途径相关酶包括磷酸蔗糖磷酸酶、蔗糖磷酸合成酶、UDP
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葡萄糖焦磷酸化酶和ADP
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葡萄糖焦磷酸化酶；所述葡萄糖衍生物中肌醇的合成途径相关酶包括肌醇
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磷酸合酶和肌醇单磷酸酶；
[0018]所述增强葡萄糖衍生物中蔗糖的出入酵母能力的蛋白包括蔗糖转运蛋白；所述增强葡萄糖衍生物中肌醇的出入酵母能力的蛋白包括肌醇转运蛋白。
[0019]1)在优选的实施方式中产葡萄糖重组酿酒酵母菌株构建方法，其特征包括但不限于：A、废除所述酵母菌株中葡萄糖代谢途径相关酶活性，B、利用酵母自身葡萄糖合成途径相关酶活性。C、利用酵母自身葡萄糖出入酵母能力；
[0020]2)在优选的实施方式中产葡萄糖重组甲醇酵母菌株构建方法，其特征包括但不限于：A、废除所述酵母菌株中葡萄糖代谢途径相关酶活性，B、利用酵母自身葡萄糖合成途径相关酶活性。C、利用酵母自身葡萄糖出入酵母能力；
[0021]3)在优选的实施方式中产氨基葡萄糖重组酵母菌株构建方法，其特征包括但不限于：A、废除所述酵母菌株中氨基葡萄糖代谢途径相关酶活性，B、增强酵母氨基葡萄糖合成途径相关酶活性。C、利用酵母自身氨基葡萄糖出入酵母能力；
[0022]4)在优选的实施方式中产蔗糖重组酵母菌株构建方法，其特征包括但不限于：A、废除所述酵母菌株中蔗糖代谢途径相关酶活性，B、增强蔗糖合成途径相关酶活性。C、利用酵母自身葡萄糖及其衍生物出入酵母能力；
[0023]5)在优选的实施方式中产肌醇重组酵母菌株构建方法，其特征包括但不限于：A、废除所述酵母菌株中葡萄糖代谢途径相关酶活性，B、增强肌醇合成途径相关酶活性。C、利用酵母自身肌醇出入酵母能力。
[0024]在第二方面，本专利技术提供一种高产葡萄糖及其衍生物的重组酿酒酵母菌株。
[0025]包括以下任一所述的重组酵母菌株：
[0026]1)通过敲除酿酒酵母/甲醇酵母中葡萄糖激酶及相关己糖激酶的同工酶编码基因，获得的葡萄糖利用缺陷且具备分泌葡萄糖能力的重组酵母菌株A；
[0027]2)以重组酵母菌株A可选地敲除己糖激酶的同工酶基因，过表达葡萄糖磷酸酶和大肠杆菌的HAD4，或，过表达大肠杆菌的HAD4，得到提高葡萄糖合成产量的重组酵母菌株E
作为出发菌株，插入若干个拷贝氨基葡萄糖6
‑
磷酸磷酸酶GlmP和氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氨酶GlmD，获得具有分泌氨基葡糖能力的重组酵母菌株B，优选插入三个拷贝GlmD和GlmP，或插入三个拷贝GlmD和四个拷贝GlmP；
[0028]3)通过敲除酵母中蔗糖酶、麦芽糖酶及异麦芽糖酶编码基因，插入蔗糖转运蛋白SUF1和插入一个或以上拷贝的磷酸蔗糖磷酸酶SPP和蔗糖磷酸合酶SPS，获得蔗糖利用缺陷且具备分泌蔗糖能力的重组酵母菌株C；
[0029]4)通过在酵母中插入内源肌醇
‑3‑
磷酸合酶INO1和外源肌醇单磷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组酵母生产葡萄糖及其衍生物菌株的构建方法，其特征在于包括以下(
ⅰ‑ⅲ
)中的任一项：
ⅰ
、敲除酵母菌株中葡萄糖及其衍生物代谢途径相关酶；
ⅱ
、增强或利用酵母菌株自身葡萄糖及其衍生物合成途径相关酶活性；
ⅲ
、增强或利用酵母菌株自身葡萄糖及其衍生物出入酵母能力；优选所述酵母菌株包括酿酒酵母、甲醇酵母、产油酵母；更优选酿酒酵母及甲醇酵母。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述葡萄糖代谢途径相关酶包括葡萄糖激酶和相关己糖激酶的同工酶；所述葡萄糖衍生物中蔗糖的代谢途径相关酶包括蔗糖酶、麦芽糖酶和异麦芽糖酶；所述葡萄糖合成途径相关酶包括葡萄糖磷酸酶，优选葡萄糖磷酸酶包括葡萄糖
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磷酸酶、葡萄糖
‑6‑
磷酸酶；所述葡萄糖衍生物中氨基葡糖的合成途径相关酶包括氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸磷酸酶和氨基葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氨酶；所述葡萄糖衍生物中蔗糖的合成代谢途径相关酶包括磷酸蔗糖磷酸酶、蔗糖磷酸合成酶、UDP
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葡萄糖焦磷酸化酶和ADP
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葡萄糖焦磷酸化酶；所述葡萄糖衍生物中肌醇的合成途径相关酶包括肌醇
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磷酸合酶和肌醇单磷酸酶；所述增强葡萄糖衍生物中蔗糖的出入酵母能力的蛋白包括蔗糖转运蛋白；所述增强葡萄糖衍生物中肌醇的出入酵母能力的蛋白包括肌醇转运蛋白。3.一种重组酵母菌株，其特征在于包括以下(1
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4)中的任一项：1)通过敲除酿酒酵母/甲醇酵母中葡萄糖激酶及相关己糖激酶的同工酶编码基因，获得的葡萄糖利用缺陷且具备分泌葡萄糖能力的重组酵母菌株A；2)以上述第1)种重组酵母菌株A可选地敲除己糖激酶的同工酶基因，过表达葡萄糖磷酸酶和大肠杆菌的HAD4，或，过表达大肠杆菌的HAD4，得到提高葡萄糖合成产量的重组酵母菌株E作为出发菌株，插入若干个拷贝氨基葡萄糖6
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磷酸磷酸酶GlmP和氨基葡萄糖
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磷酸脱氨酶GlmD，获得具有分泌氨基葡糖能力的重组酵母菌株B，优选插入三个拷贝GlmD和GlmP，或插入三个拷贝GlmD和四个拷贝GlmP；3)通过敲除酵母中蔗糖酶、麦芽糖酶及异麦芽糖酶编码基因，插入蔗糖转运蛋白SUF1和插入一个或以上拷贝的磷酸蔗糖磷酸酶SPP和蔗糖磷酸合酶SPS，获得蔗糖利用缺陷且具备分泌蔗糖能力的重组酵母菌株C；4)通过在酵母中插入内源肌醇
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磷酸合酶INO1和外源肌醇单磷酸酶SuhB，插入肌醇转运蛋白ITR1，获得肌醇利用缺陷且具备分泌肌醇能力的重组酵母菌株D；其中优选酵母包括酿酒酵母、甲醇酵母、产油酵母。4.如权利要求3所述的一种重组酵母菌株，其特征在于，所述1)中重组酵母菌株A的具体构建方法为：当选用酿酒酵母时，通过敲除酿酒酵母中葡萄糖激酶活性的葡萄糖激酶基因glk1及两个己糖激酶的同工酶基因hxk1、hxk2，获得葡萄糖利用缺陷且具备分泌葡糖能力的重组酿酒酵母菌株A；当选用甲醇酵母时，通过敲除甲醇酵母中葡萄糖激酶活性的葡萄糖激酶基因glk1及己糖激酶的同工酶基因hxk1，获得葡萄糖利用缺陷且具备分泌葡萄糖能力的重组甲醇酵母菌株A；所述3)中重组酵母菌株C的具体构建方法为：当所述酵母为酿酒酵母时，通过敲除蔗糖
酶的活性基因suc2、麦芽糖酶的活性基因mal12、mal22、mal32、异麦芽糖酶的活性基因ims1、ima2、ima3、ima4、ima5，获得蔗糖利用缺陷能力的重组酿酒酵母菌株；过表达来自豌豆的蔗糖转运蛋白SUF1、来自聚囊藻的磷酸蔗糖磷酸酶SPP和蔗糖磷酸合酶SPS，获得蔗糖利用缺陷能力且具有蔗糖分泌能力的重组酵母菌株C。5.如权利要求3所述的一种重组酵母菌株，其特征在于更优选为：a)将所述重组酵母菌株A可选地敲除己糖激酶的同工酶基因，过表达葡萄糖磷酸酶和大肠杆菌的HAD4，或，过表达大肠杆菌的HAD4，得到提高葡萄糖合成产量的重组酵母菌株E；b)将所述重组酵母菌株B敲除酵母内源基因reg1，得到提高氨基葡糖合成产量的重组酵母菌株F；c)将所述重组酵母菌株C插入葡萄糖焦磷酸化酶GlgC突变体和UGP1分别增加前体物质ADP
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Glc和UDP
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Glc，得到提高蔗糖合成产量的重组酵母菌株G；d)所述重组酵母菌株D敲除磷酸果糖激酶1和磷酸果糖激酶2，过表达谷氨酸转氢酶GDH1，得到提高肌醇合成产量的重组酵母菌株H。6.如权利要求3或5所述的一种重组酵母菌株，其特征在于，所述葡萄糖磷酸酶具备葡萄糖
‑1‑
磷酸和/或葡萄糖
‑6‑
磷酸活性，所述葡萄糖磷酸酶、葡萄糖焦磷酸化酶GlgC/UGP1、谷氨酸转氢酶、氨基葡萄糖
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磷酸磷酸酶GlmP、氨基葡萄糖
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6磷酸脱氨酶GlmD、磷酸蔗糖磷酸酶SPP、蔗糖磷酸合酶SPS、蔗糖转运蛋白、肌醇
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磷酸合酶、肌醇单磷酸酶、肌醇转运蛋白的来源为酵母自身或者其他真核、原核生物的异源酶或特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：于涛，吴良焕，汤红婷，郭姝媛，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：