一种L-薄荷醇产量提高的酿酒酵母菌株制造技术

本发明专利技术公开了一种L

【技术实现步骤摘要】
一种L
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薄荷醇产量提高的酿酒酵母菌株


[0001]本专利技术涉及一种L
‑
薄荷醇产量提高的酿酒酵母菌株，属于代谢工程


技术介绍

[0002]L
‑
薄荷醇(L
‑
Menthol)是一种环状单萜烯醇，无色或白色针状结晶，分子式为C
10
H
20
O，含有三个手性碳原子。在众多异构体中，L
‑
薄荷醇由于其独特的薄荷风味和清凉特效，被广泛应用于食品药品以及日化品行业。目前L
‑
薄荷醇的生产方法主要为植物提取和化学合成，植物提取法受天气、地理等自然条件的限制，不利于其在工业上的应用，化学合成步骤繁琐，副产物较多，分离提取困难。随着合成生物学的迅猛发展，在工程菌株中异源表达来源于植物的基因，让微生物法合成薄荷醇成为可能。微生物法不受自然条件制约，合成周期短，对环境污染小，经济效益高，适合大规模生产。
[0003]申请人在前期构建了一株重组酿酒酵母工程菌WMT4，首次实现了发酵法生产L
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薄荷醇，利用廉价的发酵培养基培养4d左右，L
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薄荷醇的发酵产量达到5.03mg/L。随后利用诱导型启动子表达法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20
WW
，构建的酿酒酵母工程菌WMT5，发酵产量达到8.56mg/L。利用诱导型启动子表达橙花二磷酸合酶NPPS，构建的酿酒酵母工程菌WMT6，发酵产量达到11.56mg/L；以酿酒酵母工程菌WMT4为出发菌株，利用诱导型启动子共表达ERG20WW与NPPS基因，构建的酿酒酵母工程菌WMT7，发酵产量达到14.36mg/L。以酿酒酵母工程菌WMT7为出发菌株，利用诱导型启动子过表达L
‑
薄荷醇代谢途径中的关键酶基因柠檬烯羟基化酶基因L3H，提高L3H酶的表达量，解除L
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薄荷醇后续合成步骤的代谢通量限制瓶颈，构建得到的酵母酿酒酵母工程菌WMT8，发酵产量达到18.74mg/L；以酿酒酵母工程菌WMT7为出发菌株，利用诱导启动子过表达融合蛋白tLimS
‑
L3H基因，提高L
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薄荷醇代谢途径的催化效率，构建得到的酵母酿酒酵母工程菌WMT9，L
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薄荷醇的发酵产量达到30.14mg/L。但是实际上，菌株WMT9的柠檬烯产量可以达到327.78mg/L，而最终合成的L
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薄荷醇产量仅有30.14mg/L，代谢中间产物的转化效率低。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术通过在tLimS和IDI、tLimS和L3H的C端添加RIDD
‑
RIAD短肽进行酶组装，拉近两个酶之间的距离，提高薄荷醇的产量。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供一种L
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薄荷醇产量提高的酿酒酵母菌株，所述的酿酒酵母菌株是在柠檬烯合成酶tLimS和异戊二烯二磷酸异构酶IDI的C端分别添加RIDD和RIAD短肽，或在柠檬烯合成酶tLimS和柠檬烯羟基化酶L3H的C端分别添加RIDD和RIAD短肽。
[0006]进一步地，所述的柠檬烯合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术中的柠檬烯合成酶tLimS为柠檬烯合成酶LimS去除前56个氨基酸序列形成。
[0007]SEQ ID NO.1所示的序列：
[0008]MERRSGNYNPSRWDVNFIQSLLSDYKEDKHVIRASELVTLVKMELEKETDQIRQLELIDDLQRMGLSDHFQNEFKEILSSIYLDHHYYKNPFPKEERDLYSTSLAFRLLREHGFQVAQEVFDSFKNEEGEFKESLSDDTRGLLQ
LYEASFLLTEGETTLESAREFATKFLEEKVNEGGVDGDLLTRIAYSLDIPLHWRIKRPNAPVWIEWYRKRPDMNPVVLELAILDLNIVQAQFQEELKESFRWWRNTGFVEKLPFARDRLVECYFWNTGIIEPRQHASARIMMGKVNALITVIDDIYDVYGTLEELEQFTDLIRRWDINSIDQLPDYMQLCFLALNNFVDDTSYDVMKEKGVNVIPYLRQSWVDLADKYMVEARWFYGGHKPSLEEYLENSWQSISGPCMLTHIFFRVTDSFTKETVDSLYKYHDLVRWSSFVLRLADDLGTSVEEVSRGDVPKSLQCYMSDYNASEAEARKHVKWLIAEVWKKMNAERVSKDSPFGKDFIGCAVDLGRMAQLMYHNGDGHGTQHPIIHQQMTRTLFEPFA。
[0009]进一步地，所述的异戊二烯二磷酸异构酶IDI的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]SEQ ID NO.2所示的序列：
[0011]MTADNNSMPHGAVSSYAKLVQNQTPEDILEEFPEIIPLQQRPNTRSSETSNDESGETCFSGHDEEQIKLMNENCIVLDWDDNAIGAGTKKVCHLMENIEKGLLHRAFSVFIFNEQGELLLQQRATEKITFPDLWTNTCCSHPLCIDDELGLKGKLDDKIKGAITAAVRKLDHELGIPEDETKTRGKFHFLNRIHYMAPSNEPWGEHEIDYILFYKINAKENLTVNPNVNEVRDFKWVSPNDLKTMFADPSYKFTPWFKIICENYLFNWWEQLDDLSEVENDRQIHRML。
[0012]进一步地，所述的柠檬烯羟基化酶L3H的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0013]SEQ ID NO.3所示的序列：
[0014]MELQISSAIIILVVTYTISLLIIKQWRKPKPQENLPPGPPKLPLIGHLHLLWGKLPQHALASVAKQYGPVAHVQLGEVFSVVLSSREATKEAMKLVDPACADRFESIGTKIMWYDNDDIIFSPYSVHWRQMRKICVSELLSARNVRSFGFIRQDEVSRLLGHLRSSAAAGEAVDLTERIATLTCSIICRAAFGSVIRDHEELVELVKDALSMASGFELADMFPSSKLLNLLCWNKSKLWRMRRRVDAILEAIVEEHKLKKSGEFGGEDIIDVLFRMQKDSQIKVPITTNAIKAFIFDTFSAGTETSSTTTLWVMAELMRNPEVMAKAQAEVRAALKGKTDWDVDDVQELKYMKSVVKETMRMHPPIPLIPRSCREECEVNGYTIPNKARIMINVWSMGRNPLYWEKPETFWPERFDQVSRDFMGNDFEFIPFGAGRRICPGLNFGLANVEVPLAQLLYHFDWKLAEGMNPSDMDMSEAEGL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
‑
薄荷醇产量提高的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述的酿酒酵母菌株是在柠檬烯合成酶tLimS和异戊二烯二磷酸异构酶IDI的C端分别添加RIDD和RIAD短肽，或在柠檬烯合成酶tLimS和柠檬烯羟基化酶L3H的C端分别添加RIDD和RIAD短肽。2.根据权利要求1所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述的柠檬烯合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述的异戊二烯二磷酸异构酶IDI的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述的柠檬烯羟基化酶L3H的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。5.根据权利要求1所述的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述的RIDD的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。6.根据权利要求1所述的酿酒酵母菌株，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，孙正艳，吕雪芹，崔佳，堵国成，方杰，李江华，董金儒，刘延峰，王凌锐，
申请(专利权)人：鄂尔多斯市中轩生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：