一种海藻酸裂解酶高产菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种海藻酸裂解酶高产菌株及其应用。所述菌株为毕赤酵母ALGF

【技术实现步骤摘要】
一种海藻酸裂解酶高产菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种海藻酸裂解酶高产菌株及其应用。

技术介绍

[0002]海藻酸裂解酶是一种重要的工业酶，广泛应用于寡糖制备、生物能源生产和制药工程等领域。海藻酸裂解酶大多数来自海洋，例如海藻类，软体动物，微生物和海洋细菌。根据其剪切方式的不同分为内切型海藻酸裂解酶和外切型海藻酸裂解酶；根据底物特异性可以分为poly M特异性、poly G特异性以及对Poly M和Poly G都具有活性的Poly MG裂解酶。海藻酸裂解酶通过β
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消除反应断裂海藻酸分子间的1,4
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糖苷键，内切型海藻酸裂解酶切割海藻酸聚合物的糖苷键生成的主要产物为不饱和寡糖（二糖、三糖和四糖），并在其非还原端的C4和C5之间形成双键，而外切型藻酸盐裂解酶产生不饱和单糖。海藻酸裂解酶得到的最终产物是不饱和单糖，不饱和单糖通过非酶促反应转变为4
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脱氧
‑
L
‑
赤
‑5‑
己糖酮糖醛酸（DEH）。
[0003]研究发现，海藻酸裂解酶和抗生素联合使用可有效治疗囊性纤维化，含有抗生素如庆大霉素的海藻酸裂解酶能够增加呼吸道中粘液的杀伤力，因此海藻酸裂解酶可以被用来治疗细菌粘液生物膜依赖性疾病。海藻酸裂解酶也可以被用来制备藻类的原生质体进行基因工程改造和墨角藻细胞壁的研究。同时，海藻酸裂解酶在生物技术的应用中具有重要的作用，具有不同底物特异性的海藻酸裂解酶可以用来产生许多具有生物功能的寡糖。此外，海藻酸裂解酶也可以被用于海藻酸精细结构的确定和特定模式海藻酸的制备，具有活性的海藻酸裂解酶可以进一步利用乙酰化的海藻酸联合抗生素进行囊性纤维化的治疗。
[0004]近年来，随着海藻酸及其寡糖越来越多地应用于化工、医药、农业、分子生物学、海洋生物学等领域，海藻酸裂解酶日益成为海洋生物资源开发的竞争热点。发展大型海藻饲料可充分利用海域资源，保护水生生物资源。同时，大型海藻饲料富含生物活性物质，可促进养殖业和健康发展，为人民提供营养丰富的健康食品，因此利用海藻酸裂解酶生产加工大型海藻饲料具有广阔的发展前景。随着酶的发展，具有高活性和广泛底物特异性的新酶的分离和特性描述将会提高和扩大海藻酸裂解酶的应用，以便生产出可以应用到许多领域的具有新颖结构和生物活性的寡糖。有研究表明，海藻酸裂解酶在酵母菌株中进行表达，利用其具有甲醇诱导的强启动子，表达后通过加工、折叠使异源蛋白分泌到胞外，有利于产生活性蛋白，从而简化纯化过程，降低生产成本，为实现海藻酸裂解酶的工业化生产提供了可能性。

技术实现思路

[0005]本专利技术为解决现有技术问题，提供了一种海藻酸裂解酶高产菌株及其应用。所述菌株是通过紫外诱变方法筛选获得的突变菌，海藻酸裂解酶产量得到显著提高，有利于降低该酶的生产成本，促进其广泛应用。
[0006]本专利技术一方面提供了一种海藻酸裂解酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码
的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
[0007]本专利技术一方面提供了一种重组质粒，其携带有上述海藻酸裂解酶基因。
[0008]本专利技术还提供了一种毕赤酵母工程菌，其携带有上述重组质粒。
[0009]本专利技术还提供了一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。
[0010]所述突变菌株为毕赤酵母ALGF
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71（Pichia pastoris ALGF
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71）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221119。
[0011]本专利技术还提供了一种发酵生产海藻酸裂解酶的方法，是以上述毕赤酵母突变菌为发酵菌株。
[0012]有益效果本专利技术提供的突变菌株毕赤酵母ALGF
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71，能显著提高海藻酸裂解酶的表达量，其摇瓶发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活高达3442U/ml，比出发菌提高了55%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可作为海藻酸裂解酶的发酵生产菌株，有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。
具体实施方式
[0013]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。
[0014]菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、G418购自Invitrogen公司。
[0015]酶与试剂：DNA聚合酶、T4连接酶、限制性内切酶购自Takara公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，其他化学试剂为国产或进口分析纯试剂。
[0016]实施例中所述海藻酸裂解酶酶活检测方法如下：（1）海藻酸裂解酶酶活单位的定义在40℃、pH7.5的条件下，每分钟降解底物海藻酸钠产生不饱和键，在235nm下，吸光度每增加0.1，为一个酶活单位U。
[0017]（2）试剂磷酸缓冲液（0.05M，pH7.5）1）配制0.05M磷酸二氢钠溶液称取3.9g二水合磷酸二氢钠，去离子水溶解后，定容至500ml。
[0018]2）配制0.05m磷酸氢二钠溶液称取17.91g十二水合磷酸氢二钠，去离子水溶解后，定容至1000ml。
[0019]3）混合配制0.05M磷酸缓冲液将2中的磷酸氢二钠溶液放置于2L烧杯中，用1中的磷酸二氢钠溶液调节其pH至7.5。
[0020]底物：0.3%海藻酸钠溶液取100ml小烧杯，加入约80ml磷酸缓冲液；称取0.3g海藻酸钠，磁力搅拌条件下均匀加入到小烧杯中，搅拌至溶解；用磷酸缓冲液定容至100ml，配制当天使用。
[0021]终止液：0.06mol/L的磷酸终止液。根据不同的磷酸浓度进行计算。
[0022]（3）海藻酸裂解酶酶活测定步骤取三支15mm
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150mm试管，加入1.8ml底物，40℃水浴预热5min，加入准备好的酶液0.2ml，准确计时，涡旋振荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2ml磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。
[0023]空白：取15mm*150mm试管，加入1.8ml底物，40℃水浴预热5min，加入0.2ml缓冲液，准确计时，涡旋振荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2ml磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。
[0024]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海藻酸裂解酶基因，其特征在于，所述海藻酸裂解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。2.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求1所述的海藻酸裂解酶基因。3.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌携带有权利要求 2所述的重组质粒。4.一种毕赤酵母突变菌，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲍锴，程斯达，康丽华，张静静，
申请(专利权)人：潍坊康地恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：