一种大肠杆菌重组核酸、重组大肠杆菌及培养方法和生物合成L-苏氨酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种大肠杆菌重组核酸、重组大肠杆菌及培养方法和生物合成L

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌重组核酸、重组大肠杆菌及培养方法和生物合成L
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苏氨酸的方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种大肠杆菌重组核酸、重组大肠杆菌及培养方法和生物合成L
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苏氨酸的方法。

技术介绍

[0002]苏氨酸是一种必需的氨基酸，主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。由于苏氨酸的结构中含有羟基，对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。苏氨酸制剂具有促进人体发育和抗脂肪肝的药用效能，是复合氨基酸输液中的一个成分。同时苏氨酸是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸，近年来全球人口对肉类物品的需求呈现持续快速增长的趋势，因此L
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苏氨酸的市场需求也在不断增加。
[0003]目前，L
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苏氨酸生产方法主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生产成本低、生产强度高、对环境污染小，成为工业化生产L
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苏氨酸最广泛的方法。目前生产L
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苏氨酸的菌株主要包括大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、粘质沙雷氏菌。SangYup Lee等运用系统生物学方法从E coli W3100(1acI
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)出发，构建的工程菌株发酵50h产L
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苏氨酸82.4g/L，糖酸转化率为39.3％。天津大学乔建军以THRD为出发菌株，通过两段碳分配和辅因子生成策略提高L
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苏氨酸的产量，菌株40h生成70.8g/L的L
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苏氨酸，糖酸转化率40.4％。华东理工大学沈琼通过强化L
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苏氨酸合成途径关键酶和L
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苏氨酸分泌有关基因，构建基因工程菌E coli VNBKB.3507，其发酵48h产L
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苏氨酸52.7g/L。江南大学王小元通过代谢工程改造大肠杆菌TWF001，经过36h摇瓶培养后，可产生15.85g/L L
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苏氨酸，糖酸转化率为53％。
[0004]目前，利用大肠杆菌生产苏氨酸的菌株，L
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苏氨酸的产量和糖酸转化率仍然有很大的提升空间，而且通过质粒过表达关键基因的方法需要在发酵过程中加入抗生素来保持质粒的稳定性，不仅增加了安全隐患也提高了发酵成本，因此开发一种无质粒的高效合成L
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苏氨酸重组菌株，对工业生产具有重要意义。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种大肠杆菌重组核酸、重组大肠杆菌及培养方法和生物合成L
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苏氨酸的方法，基于系统代谢工程改造和优化策略，获得高效合成L
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苏氨酸的大肠杆菌重组菌株。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种大肠杆菌重组核酸，所述重组核酸包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的编码基因、丙酮酸羧化酶pyc的编码基因和苏氨酸操纵子的编码基因。
[0008]优选的，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的编码基因、丙酮酸羧化酶pyc的编码基因和苏氨酸操纵子的编码基因均由Trc启动子启动表达。
[0009]优选的，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的编码基因来源于枯草芽孢杆菌；
[0010]所述丙酮酸羧化酶pyc的编码基因来源于地衣芽孢杆菌。
[0011]优选的，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck经RBS优化和143位甘氨酸突变为精氨酸；
[0012]所述丙酮酸羧化酶pyc经RBS优化和247位丙氨酸突变为赖氨酸。
[0013]优选的，所述苏氨酸操纵子经RBS优化和144位丙氨酸突变为天冬氨酸。
[0014]本专利技术还提供了一种包含上述重组核酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck、丙酮酸羧化酶pyc和苏氨酸操纵子。
[0015]优选的，所述重组大肠杆菌的基础菌株包括大肠杆菌K
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12W3110。
[0016]本专利技术还提供了上述重组大肠杆菌的培养方法，包括以下步骤：将所述重组大肠杆菌接种于种子培养基上进行培养，得种子液；所述种子培养基包括以下浓度的组分：玉米浆干粉5g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，KH2PO
4 2g/L，硫酸镁1g/L，FeSO4·
7H2O 20mg/L和MnSO4
·
H2O 20mg/L。
[0017]本专利技术还提供了上述重组大肠杆菌在生物合成L
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苏氨酸中的应用，所述重组大肠杆菌以葡萄糖为发酵底物。
[0018]本专利技术还提供了一种生物合成L
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苏氨酸的方法，包括以下步骤：将利用上述培养方法得到的种子液接种于发酵培养基中，进行有氧发酵，发酵液中含L
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苏氨酸；
[0019]所述发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母粉3g/L，甜菜碱1g/L，硫酸镁1g/L，FeSO4·
7H2O 10mg/L，MnSO4·
H2O 10mg/L，玉米浆干粉8g/L和维生素B110mg/L。
[0020]有益效果：本专利技术提供了大肠杆菌重组核酸，包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的编码基因、丙酮酸羧化酶pyc的编码基因和苏氨酸操纵子的编码基因。利用所述重组核酸对大肠杆菌的基因组进行改造，利用CRISPR
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Cas9技术对质粒进行基因改造，通过CRISPR
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Cas9技术完成基因改造目的后，会将CRISPR
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Cas9体系中的质粒从大肠杆菌中去除，因此在最后苏氨酸发酵过程中获得不含质粒的重组大肠杆菌LMT4，以葡萄糖为底物，利用所述重组大肠杆菌LMT4进行发酵生产，L
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苏氨酸产量以及转化率明显提高，为L
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苏氨酸的工业化生产奠定基础。本专利技术实施例中，利用所述重组大肠杆菌LMT4，以葡萄糖为底物，在5L发酵罐内发酵48h，可产生160g/L苏氨酸，糖酸转化率达到60％，表明本专利技术所述高效合成L
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苏氨酸的重组菌株具有广泛的工业应用前景。
附图说明
[0021]图1为重组菌株LMT4在5L发酵罐中L
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苏氨酸产量图；
[0022]图2为重组菌株LMT4在5L发酵罐中生长曲线图；
[0023]图3为pGRB载体质粒图；
[0024]图4为CRISPR
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Cas9质粒图谱。
具体实施方式
[0025]本专利技术提供了一种大肠杆菌重组核酸，所述重组核酸包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的编码基因、丙酮酸羧化酶pyc的编码基因和苏氨酸操纵子的编码基因。
[0026]本专利技术优选以大肠杆菌为出发菌株，并通过基因编辑的方式，敲除所述出发菌株的假基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌重组核酸，其特征在于，所述重组核酸包括磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的编码基因、丙酮酸羧化酶pyc的编码基因和苏氨酸操纵子的编码基因。2.根据权利要求1所述重组核酸，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的编码基因、丙酮酸羧化酶pyc的编码基因和苏氨酸操纵子的编码基因均由Trc启动子启动表达。3.根据权利要求1所述重组核酸，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck的编码基因来源于枯草芽孢杆菌；所述丙酮酸羧化酶pyc的编码基因来源于地衣芽孢杆菌。4.根据权利要求1或3所述重组核酸，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck经RBS优化和143位甘氨酸突变为精氨酸；所述丙酮酸羧化酶pyc经RBS优化和247位丙氨酸突变为赖氨酸。5.根据权利要求1所述重组核酸，其特征在于，所述苏氨酸操纵子经RBS优化和144位丙氨酸突变为天冬氨酸。6.一种包含权利要求1～5任一项所述重组核酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶pck、丙酮酸羧化酶pyc和苏氨酸操纵子。7.根据权利要求6所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的基础菌株包括大肠杆菌K
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【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，赵振强，徐美娟，张显，杨套伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：