一种高产脂肪酶的毕赤酵母突变菌株制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产脂肪酶的毕赤酵母突变菌株及其应用。所述突变菌是通过紫外诱变的方法获得的，脂肪酶得到产量显著提高，命名为毕赤酵母ZT

【技术实现步骤摘要】
一种高产脂肪酶的毕赤酵母突变菌株


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种高产脂肪酶的毕赤酵母突变菌株及其在脂肪酶生产中的应用。

技术介绍

[0002]脂肪酶（Lipase）又称三酰基甘油酰基水解酶，属于羧基酯水解酶类，是酯酶的一个分类，具有水解甘油三酯（TG）使之成为甘油和脂肪酸（FA）的能力。脂肪酶在自然界中来源广泛，动物、植物及微生物均具有生产脂肪酸的能力，其中细菌、真菌和酵母产生的脂肪酶活力很高，而且微生物繁殖迅速，因而具有比动植物源脂肪酶更广泛的作用pH值和温度范围。与动植物来源脂肪酶相比，微生物产生的脂肪酶成本较低、更易分离纯化、生产较为方便等，因而更具有研究价值。
[0003]目前，对脂肪酶的研究主要集中于脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）、激素敏感脂肪酶（hormone
‑
sensitive lipase，HSL）、单酰甘油脂肪酶（monoacylglycerol lipase，MGL），这3种酶在机体内脂肪及非脂肪组织中对脂质代谢及分解具有明确的功能。在TG的水解过程中，这3种酶表现出“顺序”催化的功能，即ATGL首先将TG水解为二酰甘油（diacylglycerol，DAG）和1分子FA；再由HSL继续催化，将DAG转化为单酰甘油（monoacylglycerol，MAG）和1分子FA；最后由MGL发挥催化作用，将MAG分解为甘油和FA；为保证机体内水解平衡性，DAG和MAG还可通过二酰基甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT）和单酰基甘油酰基转移酶（monoacyglycerol acyltransferases，MGAT）发生酯化过程再次生成TAG。
[0004]脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，广泛应用于造纸、油脂加工、食品、医药、日化等工业。1. 清洁剂工业：其做为家庭或工业用清洁剂的添加物，是脂肪酶的最大商业应用领域。2. 食品工业：利用脂肪酶生产兼具机能性与保健疗效的新结构油脂及其衍生物，增加油脂的广泛应用性，提升油脂工业的经济效益与发展潜力。3. 纤维及造纸工业：脂肪酶的添加使木棉纤维精炼过程变得简单，且不损伤木棉纤维，去除纸浆中的树脂（三酸甘油酯、蜡），避免造纸过程中会产生严重破裂的情形。4. 生物能源：天然油脂和餐厨废弃油等与柴油的分子量范围较为接近，油脂的主要成分为脂肪酸与甘油形成的酯，用脂肪酶将油脂水解，再经一系列化学转化即可获取生物柴油。5. 制药工业：利用脂肪酶独特的立体镜像选择性，可以有效率地区别具有光学活性的立体异构物，以合成多种药物。6. 造酒：在白酒生产中可以通过脂肪酶催化形成酯类化合物以增添白酒的风味，同时打开被脂肪包埋的淀粉加快发酵速度。
[0005]脂肪酶作为生产生活中重要的酶之一，现已有越来越多的研究者对其进行多方面的研究。为满足市场的大量需求，寻求高产稳产脂肪酶菌株具有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种毕赤酵母突变菌株及其在脂肪酶生产中的应用。所述突
变菌是通过紫外诱变方法筛选获得的脂肪酶高产菌株，可广泛应用于该酶的生产。
[0007]本专利技术一方面涉及一种重组表达载体，其携带有脂肪酶基因。
[0008]所述脂肪酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
[0009]本专利技术一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有上述重组表达载体。
[0010]本专利技术还涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。
[0011]所述突变菌株为毕赤酵母ZT
‑
42（Pichia pastoris ZT
‑
42），已于2022年7月15日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221118。
[0012]本专利技术还涉及一种发酵生产脂肪酶的方法，是以上述毕赤酵母突变菌为发酵菌株。
[0013]有益效果本专利技术首先构建得到重组表达脂肪酶基因的工程菌毕赤酵母ZT，其摇瓶发酵上清液中脂肪酶酶活最高达到8650U/ml；然后以毕赤酵母ZT为出发菌，通过紫外诱变筛选获得突变菌株毕赤酵母ZT
‑
42，能大幅度提高脂肪酶的表达量，其摇瓶发酵上清液中脂肪酶酶活高达19610U/ml，比出发菌提高了127%，取得了意料不到的技术效果。
[0014]所述突变菌株可作为脂肪酶的发酵生产菌株，有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。
具体实施方式
[0015]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。
[0016]菌株与载体：毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、G418购自Invitrogen公司。
[0017]试剂：DNA聚合酶购买自Takara公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司。其余试剂均为国产分析纯。
[0018]本专利技术实施例中所述脂肪酶的酶活测定方法如下：（1）酶活定义：在40℃、pH值为7.5的条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
[0019]（2）底物溶液：秤取聚乙烯醇（PVA：聚合度1750
±
50）40g，加水800ml，浸泡4
‑
6h，在沸水浴中加热，搅拌，直至全部溶解，搅拌冷却后定容至1000ml，用干净的6
‑
8层纱布过滤，取滤液备用。量取上述滤液150ml，加橄榄油50ml，用高速匀浆机处理10min（分4次处理，间隔5min，每次处理2
‑
3min），即得乳白色PVA乳化液。现用现配。
[0020]（3）测定方法：取两个100ml三角瓶，分别于空白瓶（A）和样品瓶（B）中各加入底物溶液4ml和pH 7.5磷酸缓冲液5ml，再于空白瓶（A）中加入95%乙醇15ml，于40℃水浴中预热5min；向空白瓶（A）和样品瓶（B）中各加入待测酶液1ml，立即混匀计时，准确反应15min后，
使用分样移液器于样品瓶（B）中立即补加95%乙醇15ml终止反应，取出；将上述反应液倒入50ml烧杯中，向三角瓶中加入5ml纯水，摇匀后倒入50ml烧杯中，加入2滴酚酞指本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体携带有脂肪酶基因。2.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述脂肪酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。3.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌携带有权利要求1或2所述的重组表达载体。4.一种毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述的突变菌是以权利要求3所述的毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：程斯达，鲍锴，康丽华，张静静，刘文瑶，葛菁华，
申请(专利权)人：潍坊康地恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：