一种中性植酸酶生产菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种中性植酸酶生产菌株及其应用。所述突变菌株是通过紫外诱变筛选获得的，为毕赤酵母ZZ

【技术实现步骤摘要】
一种中性植酸酶生产菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种中性植酸酶生产菌株及其应用。

技术介绍

[0002]植酸酶（phytases）是指能够水解植酸及其盐类物质中磷酸单酯键而生成低级磷酸肌醇和无机磷的一类酶的总称。植酸酶普遍存在于植物、真菌、酵母和细菌中，其中微生物植酸酶因活性高、生产比较容易等诸多优点，对其研究和开发最为广泛和深入。不同来源的植酸酶多种多样，根据其最适pH值的不同，植酸酶可分为酸性植酸酶、中性植酸酶和碱性植酸酶。
[0003]中性植酸酶主要应用于消化道无胃、肠道呈中性的淡水鲤科鱼类饲料，对提高鱼类的生长效益、品质及降低饲料中植酸磷对环境的污染具有重要意义。此外，中性植酸酶还可在pH值逐渐升高至中性的单胃畜禽动物肠道中起作用，延长植酸酶在整个动物胃肠道中的作用时间，提高其有效性。中性植酸酶作为一种新型绿色饲料用酶，对于减轻因水产动物高磷粪便导致的环境污染有着极其重要的意义。
[0004]水产动物对磷的需求量大，为满足其对磷的需求，通常在配合饲料中添加较多的磷酸二氢钙，然而磷酸二氢钙为矿物磷源，非可再生。研究表明，饲料中添加中性植酸酶部分替代磷酸二氢钙并不影响鱼体的生长，并且可以提高水产动物对磷的利用率、降低磷污染，从而带来经济效益和生态效益。
[0005]随着饲料工业和养殖业的迅猛发展，饲料中未被消化利用的植酸磷对环境污染日益严重，能降解植酸磷的植酸酶已成为饲用酶制剂研究的热点。目前，在饲料上应用的植酸酶最适pH值主要是酸性的，只能在酸性条件下发挥水解植酸的能力，在pH高于6.0时，酶活性损失严重。但在中性pH值条件下具有高酶活性的植酸酶报道较少，因此，开发中性植酸酶在水产养殖中具有较大的应用潜力和商业价值。
[0006]酶制剂在鱼虾饲料中的应用已经取得了一定成效，为了使植酸酶得到更加广泛的应用，科学家们通过遗传工程和蛋白质工程等技术手段获得在酶学性质方面具有更加广泛pH作用范围、蛋白酶抗性、热稳定性提高的植酸酶，以适应动物消化道内pH条件的变化、增加蛋白酶抗性、减少饲料制粒过程中的损失。随着符合水产动物生理特点的酶制剂的开发，中性植酸酶将在水产饲料中得到更多的应用，从而提高饲料利用率，节约饲料资源，促进水产养殖业的可持续发展。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种中性植酸酶生产菌株及其应用。本专利技术通过紫外诱变方法筛选获得一株中性植酸酶高产菌株，可广泛应用于中性植酸酶的生产。
[0008]本专利技术一方面涉及一种中性植酸酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0009]本专利技术一方面涉及一种重组质粒，其携带有上述中性植酸酶基因。
[0010]本专利技术一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有上述重组质粒。
[0011]本专利技术还涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。
[0012]所述突变菌株为毕赤酵母ZZ
‑3‑
85（Pichia pastoris ZZ
‑3‑
85），已于2022年7月20日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221136。
[0013]本专利技术还涉及一种发酵生产中性植酸酶的方法，是以上述毕赤酵母突变菌为发酵菌株。
[0014]有益效果本专利技术将来源于溶纤噬菌体（Cellulophaga lytica）的中性植酸酶基因转入毕赤酵母宿主细胞中，构建得到重组表达中性植酸酶基因的工程菌，然后以该工程菌为出发菌，通过紫外诱变筛选获得突变菌株毕赤酵母ZZ
‑3‑
85。该突变菌能大幅度提高中性植酸酶的表达量，其摇瓶发酵上清液中中性植酸酶酶活高达15303U/ml，比出发菌提高了85%，可作为中性植酸酶的发酵生产菌株，有利于降低该酶的生产成本，促进其在水产饲料领域中的广泛应用。
具体实施方式
[0015]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。
[0016]试剂：植酸钠购自Sigma公司；实验所用的限制性内切酶购自TaKaRa公司；分子试剂盒购自OMEGA公司；T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司； G418购自Invitrogen公司；其它所用试剂为国产分析纯试剂。
[0017]质粒与菌株：大肠杆菌DH5α本公司保藏，毕赤酵母GS115、载体pPIC9k购自Invitrogen公司。
[0018]氨苄青霉素（Amp）：储存浓度为100mg/ml，工作浓度为100mg/l；抗生素用ddH2O溶解，滤膜（0.22μm）过滤后，
‑
20度保存。
[0019]遗传霉素G418：用ddH2O制备30ml遗传霉素（100mg/ml）储存液，过滤除菌，
‑
20度保存。
[0020]本专利技术实施例所述中性植酸酶酶活检测方法如下：1、酶活力定义在温度为25℃、pH为6.5的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
[0021]2、原理植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物。在酸性溶液中，能与钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)3PO4NH4VO3·
16MoO3]复合物，在波长
415nm下进行比色测定。
[0022]3试剂与材料本标准中所有试剂，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。清洗试验用容器要用不含磷的清洗剂。
[0023]3.10.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅰ)称取34.02g三水乙酸钠(CH3COONa
·
3H2O)于1000mL烧杯中，加入900mL水，用玻璃棒搅拌至完全溶解，用冰乙酸酸调节pH至6.50
±
0.01，并用去离子水定容至1000mL，室温下存放一个月有效，放置2周以上需要重新校准pH。
[0024]3.20.25mol/L乙酸缓冲液(Ⅱ)称取34.02g三水乙酸钠(CH3COONa
·
3H2O)、0.5gTritonX
‑
100和0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000mL烧杯中，加入900mL水，用玻璃棒搅拌至完全溶解，用冰乙酸酸调节pH至6.50
±
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中性植酸酶基因，其特征在于，所述中性植酸酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。2.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求1所述的中性植酸酶基因。3.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌携带有权利要求2所述的重组质粒。4.一种毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述的突变菌是以权利要求3所述的毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：张静静，鲍锴，程斯达，康丽华，刘文瑶，葛菁华，
申请(专利权)人：潍坊康地恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：