高比活淀粉酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体提供了一种高比活的中温淀粉酶突变体及其应用。本发明专利技术以野生型中温淀粉酶ZD7为基础，提供了包含K76L、Q224S、D325Y单个突变位点的突变体。与野生型相比，所述淀粉酶突变体的比活力普遍提高了161.5%

【技术实现步骤摘要】
高比活淀粉酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程和蛋白质改造
，具体涉及一种高比活淀粉酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，具有酶制剂的专一性，其主要作用机理是将淀粉水解成麦芽糖、葡萄糖、糊精等。淀粉是植物生长期间，以淀粉粒形式贮存于细胞中的贮存多糖，存在于种子和块茎中，如小麦中含淀粉为70％、大米为80％。淀粉不是一个单一的分子，而是一个混合物，由两种不同类型的淀粉组成，分为直链淀粉和支链淀粉两大类；淀粉酶按水解淀粉不同位置可以划分为α
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淀粉酶、β
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淀粉酶、γ
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淀粉酶、异淀粉酶；按微生物来源可以划分为细菌淀粉酶、真菌淀粉酶、霉菌淀粉酶；按反应温度可以划分为可分为中温淀粉酶和高温淀粉酶，中温淀粉酶在70℃，高温淀粉酶在90～105℃。
[0003]α
‑
淀粉酶是酶制剂中应用很广的产品，应用历史早，产量大，约占酶制剂市场25％的比例，主要应用于纺织物退浆、啤酒和酒精生产、淀粉加工、食品加工、发酵工业、医药行业以及石油开采工业等方面。α
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淀粉酶以糖原或淀粉为底物，从分子内部切开α
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1 ,4葡萄糖苷键，使底物水解成糊精和少量的葡萄糖和麦芽糖。目前在国内工业化生产上所使用的α
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淀粉酶菌株大多数是野生菌株经过诱变得到的突变菌株。通常从自然界直接分离的α
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淀粉酶野生型菌株产酶能力低下，不能满足工业生产的需要，因此如何获得具有较高产酶能力的菌株已成为当前解决淀粉酶制剂工业的关键。
[0004]随着基因工程技术的不断应用和发展，外源表达各类酶受到重视。重组蛋白表达系统主要有：大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、转基因植物或动物表达系统和体外翻译系统。但因为真核生物生长快、培养容易、遗传操作简单，同时具有对表达蛋白进行加工、修饰和折叠等特点，酵母表达系统越来越受到重视和利用。其中巴斯德毕赤酵母表达系统是发展起来的较为完善的、应用最广泛的表达系统之一。
[0005]本专利技术通过定向进化技术对中温淀粉基因进行了大量突变筛选，得到了一系列比活力大幅度提高的淀粉酶突变体。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种高比活淀粉酶突变体。所述突变体的比活力比野生型得到显著提高，有利于其在工业领域的广泛应用。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术一方面提供了一种淀粉酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0008]本专利技术一方面提供了一种淀粉酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的淀粉酶的第76位氨基酸由Lys变为Leu。
[0009]本专利技术还提供了一种淀粉酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的淀粉酶的第224位氨基酸由Gln变为Ser。
[0010]本专利技术还提供了一种淀粉酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的淀粉酶的第325位氨基酸由Asp变为Tyr。
[0011]本专利技术还涉及编码上述淀粉酶突变体的DNA分子。
[0012]本专利技术还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
[0013]本专利技术还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
[0014]所述宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）。
[0015]将上述的质粒转入宿主细胞中，重组表达的淀粉酶突变体的比活力得到显著提升。
[0016]本专利技术还提供了上述淀粉酶突变体在饲料领域中的应用。
[0017]本专利技术以野生型中温淀粉酶ZD7为基础，提供了包含K76L、Q224S或D325Y单个突变位点的突变体。在摇瓶水平下，表达野生型中温淀粉酶ZD7的转化子中发酵上清液的比活力最高达到156U/mg；而表达淀粉酶单点突变体ZD7
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1、ZD7
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2、ZD7
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3的转化子中发酵上清液的比活力最高分别达到408 U/mg、480 U/mg、614U/mg，比野生型提高了161.5%
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293.6%；其中，含D325Y单点突变的突变体ZD7
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3，其比活力最高，取得了意料不到的技术效果。
[0018]综上，本专利技术提供的中温淀粉酶突变体的比活力得到显著提高，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。
具体实施方式
[0019]本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECΜLAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECΜLAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。例如，本专利技术可选用如下实验材料和试剂：菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、pPICZA、Amp、G418、Zeocin购自Invitrogen公司。
[0020]实验试剂：DNA聚合酶购自Takara公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒和胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
[0021]培养基：LB培养基（大肠杆菌培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/ml氨苄青霉素；YPD培养基（酵母培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；YPD+Zeocin培养基：YPD培养基加100μg/ml Zeocin；MD培养基（酵母筛选培养基）：1.34% YNB，4
×
10
‑5生物素，1%甘油、2%琼脂糖；BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4
×
10
‑
5 %生物素，1%甘油；BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4
×
10
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5 %生物素，0.5%甲醇，
本专利技术实施例中所述淀粉酶的酶活检测方法参照GB/T24401
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2009。
[0022]下面结合具体实施方式，对本专利技术做进一步阐述。
[0023]实施例1 中温淀粉酶ZD7的基因合成以中温淀粉酶基因（GenBank号为WP_017474613.1）的氨基酸序列为基础，分析该中温淀粉酶的氨基酸序列，去除其自身的信号肽，再根据毕赤酵母的密码子偏本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种淀粉酶，其特征在于，所述的淀粉酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。2.一种淀粉酶突变体，其特征在于，所述淀粉酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的淀粉酶的第76位氨基酸由Lys变为Leu。3.一种淀粉酶突变体，其特征在于，所述淀粉酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的淀粉酶的第224位氨基酸由Gln变为Ser。4.一种淀粉酶突变体，其特征在于，所述淀粉酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO:2的淀粉酶的第325位氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：康丽华，鲍锴，程斯达，张静静，刘文瑶，葛菁华，
申请(专利权)人：潍坊康地恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：