一种低温淀粉酶及其在纺织中的应用制造技术

本发明专利技术通过生物信息学分析，将低温淀粉酶与中温淀粉酶的不同区域之间重组，改造成新型的低温淀粉酶，重组改造后淀粉酶比低温淀粉酶CPA、PPA酶活力及温度稳定性均有提高，最适温度比中温度淀粉酶降低。其中，获得最优的重组改造的RPA339淀粉酶，其酶活力在室温条件放置16h仍保留82%。因此改造后获得淀粉酶更适合应用于纺织领域，尤其是印染前处理的冷堆工艺中。中。

【技术实现步骤摘要】
一种低温淀粉酶及其在纺织中的应用


[0001]本专利技术属于纺织应用领域，涉及一种低温淀粉酶酶的开发及其在印染前处理中的应用。

技术介绍

[0002]σ
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淀粉酶是从淀粉内部任意水解σ
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1,4葡萄糖苷键，导致淀粉部分解聚，根据σ
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淀粉酶的热稳定性和最适反应温度，通常把σ
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淀粉酶分为高温σ
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淀粉酶、中温σ
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淀粉酶、低温σ
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淀粉酶，高温淀粉酶通常是指最适反应温度为90
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95℃、热稳定性90℃以上的淀粉酶，中温淀粉酶是指最适反应温度为60℃左右的酶；而低温淀粉酶的最适反应温度一般在40℃以下。低温淀粉酶广泛应用于造纸、食品、医药工业、纺织等领域。其中印染前处理中应用低温淀粉酶冷堆工艺中具有广阔的市场，主要原因在于冷堆工艺节约成本，能耗少。但其制约其发展的关键技术在于低温淀粉应用于冷堆退浆工艺中效率低的问题。因此急需开发一种性质优良的低温淀粉酶。
[0003]迄今，低温淀粉酶生产菌多存在酶活性不高且产量低的问题，导致生产成本高昂；其在印染前冷堆工艺中，由于气候和成本考虑，工厂中的冷堆工艺通常在室温进行。因此开发一种温度稳定性高，在10
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20℃仍有较高活性的低温淀粉酶更有利于推动行业的规模化发展。
[0004]为解决此类问题，可通过诱变、基因工程改造或进一步优化培养条件的方法获得高产且性质优良的菌株。
[0005]已有报道淀粉酶成功构建融合酶的例子：将来自Cryptococcus sp. S
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2、Thermobifida fusxa strain NTU 22 、Clostridium Butyricum T
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7的α
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淀粉酶的CBM融合，成功构建了融合酶AmyP
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Cr 、AmyP
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Th、AmyP
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Cl，并在大肠杆菌BL21 （DE3）中成功诱导表达出可溶性的融合酶，融合酶对淀粉的比活和降解率都得到了提高，且融合酶A
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S2的热稳定性也提高到野生型的5.1倍。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种低温淀粉酶，其能在低温条件下仍有较高的酶活力和酶活稳定性。
[0007]本专利技术首先提供一种淀粉酶重组的低温淀粉酶，通过生物信息学数据挖掘筛选获得中温淀粉酶BAA序列GeneBank号：WP_013352208.1)，低温淀粉酶CPA序列（GeneBank：AAZ27074.1），低温淀粉酶PPA（GeneBank：AHM24948.1）。
[0008]因此，本专利技术提供一种重组改造的淀粉酶，其特征在于，其是通过截取低温淀粉酶CPA靠近C端的第35
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220位氨基酸的序列和低温淀粉酶PPA靠近N端的第346
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451位氨基酸的序列与中温淀粉酶BAA进行重组获得，优选地是连接顺序是中温淀粉酶BAA的第1
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58个氨基酸序列、低温淀粉酶CPA靠近C端的第35
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220位氨基酸的序列、低温淀粉酶PPA靠近N端的第346
‑
451位氨基酸的序列和中温淀粉酶BAA的第346
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451个氨基酸序列依次连接。
[0009]其中，中温淀粉酶BAA序列GeneBank号：WP_013352208.1，低温淀粉酶CPA序列GeneBank号：AAZ27074.1，低温淀粉酶PPA序列GeneBank号：AHM24948.1。
[0010]本专利技术因而也提供编码所述的重组改造的淀粉酶的多核苷酸。
[0011]也提供含所述的多核苷酸的重组载体，及其重组菌。
[0012]本专利技术进一步提供一种制备所述的核苷酸的方法，其特征在于，扩增获得中温淀粉酶BAA核苷酸序列得到片段1；以低温淀粉酶CPA核苷酸序列为模板，以引物CPA339
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F：CGATTGCAGAATGATGCGGACTATATTGCTAGTTTAGGGG，CPA339
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R：tacgacgctatTGTTCTTAACTCTTTAGCTTTCGC扩增得到片段2；以低温淀粉酶PPA为模板，以引物PPA339
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F：AGTTAAGAACAatagcgtcgtattggcaac，引物PPA339
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R：TTTTGTCCCGTACATATCtccgtaatacatttgagcaatgc扩增得到片段3；使用无缝克隆酶将以上扩增完成的三片段混合，水浴中连接反应得到。
[0013]进一步通过转化至大肠杆菌，并进行测序验证。
[0014]本专利技术还提供制备所述的重组改造的淀粉酶的方法，其包括所述的重组菌，分离得到所述重组改造的淀粉酶的步骤。
[0015]本专利技术进一步提供所述的重组改造的淀粉酶在印染前处理的冷堆工艺中的应用，更具体地其用于退浆处理，优选地冷堆温度为20℃以下，进一步15℃以下浸轧。
[0016]专利技术有益效果：现有技术对淀粉酶的重组改造研究大多集中在淀粉酶的淀粉结合结构域的重组，本专利技术不同之处在于通过对低温淀粉酶C端、N端序列的截短后推测其嗜冷结构域的区域受N端或C端哪些区域的影响，具体找到低温淀粉酶CPA在C端截短50个氨基酸仍有酶活且最适温度不变，然而截短100个氨基酸后酶活消失；而低温淀粉酶PPA在N端截短100个氨基酸后仍有酶活且最适温度不变； 因此将低温淀粉酶CPA C端35
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220氨基酸与低温淀粉酶PPA N端346
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451 区域内的氨基酸融合后插入并替换中温淀粉酶59
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394区域内氨基酸。即将CPA和PPA的催化区域融合后替换BAA中温淀粉酶的催化区域，但保留中温淀粉酶的N端和C端结构域。改造后成功将中温淀粉酶BAA的最适反应温度降低，但改造后的酶活力比原始低温淀粉酶高。本专利技术中改造后获得的低温淀粉酶RPA339，其最适温度为35℃，最适pH6.5，室温25℃、16h后酶活仍有82%。改造后的低温淀粉酶RPA339更适合应用于印染前处理的冷堆工艺中。
[0017]附图说明
[0018]图1 重组改造后的淀粉酶的最适温度。
[0019]图2重组改造后的淀粉酶的最适pH值。
[0020]图3重组改造后的淀粉酶的温度稳定性。
[0021]具体实施方式
[0022]下面通过具体实施方式对本专利技术做进一步的阐述，以期更好的理解本专利技术，但不构成对本专利技术的限制。
[0023]实施例1 低温淀粉酶序列的挖掘
对CAZy 数据库中收录的淀粉酶家族现有成员进行生物信息学归纳分析，明确该家族的序列及结构特征。其次，依据生物信息学分析结果构建基于隐马尔科夫模型HMMER（http://www.hmmer.o本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组改造的淀粉酶，其特征在于，其是通过截取低温淀粉酶CPA靠近C端的第35
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220位氨基酸的序列和低温淀粉酶PPA靠近N端的第346
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451位氨基酸的序列与中温淀粉酶BAA进行重组获得，优选地是连接顺序是中温淀粉酶BAA的第1
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58个氨基酸序列、低温淀粉酶CPA靠近C端的第35
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220位氨基酸的序列、低温淀粉酶PPA靠近N端的第346
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451位氨基酸的序列和中温淀粉酶BAA的第346
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451个氨基酸序列依次连接；其中，中温淀粉酶BAA序列GeneBank号：WP_013352208.1，低温淀粉酶CPA序列GeneBank号：AAZ27074.1，低温淀粉酶PPA序列GeneBank号：AHM24948.1。2.编码如权利要求1所述的重组改造的淀粉酶的多核苷酸。3.含如权利要求2所述的多核苷酸的重组载体。4.含如权利要求3所述的重组载体的重组菌。5.一种制备如权利要求2所述的核苷酸的方法，其特征在于，扩增获得中温淀粉酶BAA核苷酸序列得到片段1；以低温淀粉酶CPA核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：付晓平，柏文琴，郑宏臣，徐健勇，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：