一种纯化透明质酸酶的方法技术

本发明专利技术提供了一种纯化透明质酸酶的方法，包括如下步骤：A)透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；B)透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；C)将低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，即得。本发明专利技术将水蛭透明质酸酶依次经板框、(低压)陶瓷膜、(高压)陶瓷超滤膜工艺及加一定浓度缓冲盐溶液流加的方式降低透明质酸酶发酵液中的菌体及小分子杂质，该工艺生产成本低，用于连续生产酶切超小分子透明质酸，不会引入额外杂质，提高酶切超小分子透明质酸产品品质，适合大规模工业化生产。业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种纯化透明质酸酶的方法


[0001]本专利技术涉及纯化方法
，尤其是涉及一种纯化透明质酸酶的方法。

技术介绍

[0002]透明质酸酶(hyaluronidase，HAase)，也称玻璃酸酶，是一种能够特异性水解透明质酸的酶类的总称。
[0003]透明质酸酶是一类能够降解透明质酸的酶的总称。早在1928年Duran Reynals在研究哺乳动物睾丸及其他组织提取物时发现了一种“扩散因子”，可以促进皮下注射的疫苗、染料、毒素等更好地扩散。1940年Meyer将这种“扩散因子”命名为Hyaluronidase。此后，人们在许多组织及生物体内检测到了透明质酸酶，包括细菌病毒、细菌、真菌等，非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物的毒液中也产生透明质酸酶。脊椎动物中，在蛇、蜥蜴的毒液中，睾丸及其他器官如肝脏、肾脏、淋巴系统及皮肤中均发现透明质酸酶的存在。
[0004]透明质酸酶纯化，专利CN201410007408.1公开了一种透明质酸酶编码基因及其发酵生产和纯化方法，该专利采用实验级离心除菌及离子交换方法纯化水蛭透明质酸酶，该方法所用试剂，溶剂较多，过程繁琐，生产效率慢，不适用于工业化生产制备酶切超小分子透明质酸。
[0005]现有技术中，纯化水蛭透明质酸酶多采用板框除菌、盐析法、无机陶瓷膜除菌、离子交换法，凝胶层析法，有机超滤法(三种或三种以上)等传统工业化方法酶活收率低，过程繁琐，生产成本高且效率低，不适用于酶切超小分子透明质酸工业化连续生产。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种纯化透明质酸酶的方法，本专利技术的方法酶活率高且不会引入额外杂质。
[0007]本专利技术提供了一种纯化透明质酸酶的方法，包括如下步骤：
[0008]A)透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；
[0009]B)透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；
[0010]C)将低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，即得。
[0011]优选的，步骤A)所述透明质酸酶来源为水蛭；所述透明质酸酶发酵液中菌体质量含量为50wt％～55wt％。
[0012]优选的，步骤A)所述透明质酸酶清液中菌体质量含量为1wt％～5wt％；
[0013]所述透明质酸酶清液的酶活为1.2
×
106～1.6
×
106U/ml。
[0014]优选的，步骤B)所述低压陶瓷膜的规格为50～200nm；所述低压陶瓷膜的膜面积为0.286m2，设备设计压力为0.3～0.35Mpa，料液温度为30～35℃。
[0015]优选的，步骤B)所述低压陶瓷膜除菌后，采用连续流加方式加缓冲盐，透析，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；所述低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液的酶活为5
×
105～7
×
105U/ml；所述缓冲盐为1％～3％的氯化钠溶液。
[0016]优选的，步骤C)所述高压陶瓷超滤膜的规格为15000～25000Da；
[0017]所述高压陶瓷超滤膜的膜面积为0.286m2，设备设计压力为0.5～0.9Mpa，设备运行中压力为0.70～0.75Mpa，料液温度为30～35℃。
[0018]优选的，步骤C)所述高压陶瓷膜除杂后，采用连续流加方式加缓冲盐，透析至透过液尾线与缓冲盐溶液浓度一致后继续流加至透过液无色，即得；所述缓冲盐为1％～3％的氯化钠溶液。
[0019]优选的，所述低压陶瓷膜的规格为200nm。
[0020]优选的，所述高压陶瓷膜的规格为15000Da。
[0021]本专利技术提供了一种透明质酸酶，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。
[0022]与现有技术相比，本专利技术提供了一种纯化透明质酸酶的方法，包括如下步骤：A)透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；B)透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；C)将低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，即得。本专利技术将水蛭透明质酸酶依次经板框、(低压)陶瓷膜、(高压)陶瓷超滤膜工艺及加一定浓度缓冲盐溶液流加的方式降低透明质酸酶发酵液中的菌体及小分子杂质，该工艺生产成本低，用于连续生产酶切超小分子透明质酸，不会引入额外杂质，提高酶切超小分子透明质酸产品品质，适合大规模工业化生产。
附图说明
[0023]图1为本专利技术实施例1透明质酸酶发酵液离心后图；
[0024]图2为本专利技术实施例1透明质酸酶清液离心后图；
[0025]图3为本专利技术实施例1低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液离心后图；
[0026]图4为本专利技术实施例1纯化透明质酸酶液图。
具体实施方式
[0027]本专利技术提供了一种纯化透明质酸酶的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本专利技术保护的范围。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。
[0028]本专利技术提供了一种纯化透明质酸酶的方法，包括如下步骤：
[0029]A)透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；
[0030]B)透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；
[0031]C)将低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，即得。
[0032]本专利技术提供了一种纯化透明质酸酶的方法，透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液。
[0033]本专利技术透明质酸酶发酵液的来源本专利技术对此不进行限定，本领域技术人员熟知的
即可，优选采用专利CN201410007408.1(一种透明质酸酶编码基因及其发酵生产和纯化方法)，进行透明质酸酶发酵。透明质酸酶来源为：水蛭来源。
[0034]本专利技术优选采用如下方式进行透明质酸酶活力检测：
[0035]透明质酸酶活力单位定义：在pH5.5和38℃下，每小时从透明质酸中释放1ug葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
[0036]平板透明圈法和CTAB(Hexadecyl trimethyl ammoniumBromide)浊度法检测透明质酸酶活性：透明质酸为大分子聚多糖，在一定浓度的表面活性剂水溶液中沉淀析出，被水解的小分子量低聚HA不会被沉淀析出。利用这一原理可以快速简便的鉴定透明质酸酶活性。
[0037]配置缓冲液(50mM的柠檬酸/柠檬酸钠pH5.3，150mM的NaCl，0.02％Na3N)，量取50ml缓冲液，加入1.5％的琼脂糖和1mg/ml的HA，融化后配置平板。将发酵液滴入孔径内部，平板置于37℃培养10h，在平板上覆盖适量的10％(w/v)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化透明质酸酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：A)透明质酸酶发酵液经板框除菌，得到透明质酸酶清液；B)透明质酸酶清液采用低压陶瓷膜除菌，得到低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液；C)将低压陶瓷膜处理后的透明质酸酶液采用高压陶瓷超滤膜除杂，即得。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)所述透明质酸酶来源为水蛭；所述透明质酸酶发酵液中菌体质量含量为50wt％～55wt％。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)所述透明质酸酶清液中菌体质量含量为1wt％～5wt％；所述透明质酸酶清液的酶活为1.2
×
106～1.6
×
106U/ml。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B)所述低压陶瓷膜的规格为50～200nm；所述低压陶瓷膜的膜面积为0.286
㎡
，设备设计压力为0.3～0.35Mpa，料液温度为30～35℃。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B)所述低压陶瓷膜除菌后，采用连续流加方式加缓冲盐，透析，得到低压陶瓷膜处理后的透...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴跃锋，毕延凯，秦立春，伍陵，陈冰瑶，向静，
申请(专利权)人：水羊化妆品制造有限公司，
类型：发明
国别省市：