一种β-淀粉酶突变体及其在麦芽糖制备中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种β

【技术实现步骤摘要】
一种
β
‑
淀粉酶突变体及其在麦芽糖制备中的应用


[0001]本专利技术涉及酶工程和和微生物工程
，具体涉及一种β
‑
淀粉酶突变体及其在麦芽糖制备中的应用。

技术介绍

[0002]β
‑
淀粉酶属于外切型糖化酶，能够从淀粉链的非还原端顺次切下麦芽糖单元，生成麦芽糖。麦芽糖被水解的同时发生沃尔登转位反应，由α
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型麦芽糖变为β
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型麦芽糖，因此称为β
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淀粉酶。该酶存在于植物和微生物中，在淀粉糖、酿造、食品加工、医药等工业生产领域具有广泛的用途，是一种重要的淀粉加工用酶。在淀粉糖行业，β
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淀粉酶是生产超高麦芽糖浆、结晶麦芽糖、麦芽糖醇等产品所必需的关键酶种。在啤酒酿造中，β
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淀粉酶可以用来生产啤酒专用糖浆，不但能减少大麦芽的用量、降低成本，而且所产啤酒泡沫细腻、口味纯正。在食品加工领域，β
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淀粉酶可用于面包、馒头、糕点和方便米饭等产品的保鲜，提高产品的货架期。在医药工业中，β
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淀粉酶可用于生产高纯度的医用针剂级麦芽糖，用于糖尿病、高血压等特殊病人在临床上补充能量，而不会造成血糖升高。随着我国相关行业的快速发展，国内对β
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淀粉酶的需求日益增加。
[0003]植物是β
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淀粉酶的最主要来源之一，早在2000多年前，人们就开始用麦芽作为糖化剂来生产饴糖。此后，越来越多植物β
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淀粉酶被发现。植物β
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淀粉酶分子量一般为53
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64kDa，最适温度为30
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60℃，最适pH为4.8
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6.0。其中，大麦β
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淀粉酶最适温度和最适pH分别为55℃和5.2，是商品化β
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淀粉酶的主要来源之一；其次是大豆β
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淀粉酶和甘薯β
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淀粉酶。但是，植物提取β
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淀粉酶仍然存在以下缺点：原料来源有限，生产需要消耗大量粮食；产品中容易混杂有其它淀粉酶，影响应用效果；需低温储存，保存成本高等。微生物是β
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淀粉酶的另一个主要来源。国内外科技工作者一直致力于筛选产β
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淀粉酶的微生物，其中日本学者在这方面的研究最早。Higashihara于上世纪70年代首次发现了巨大芽孢杆菌β
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淀粉酶。此后，多粘芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等多种微生物β
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淀粉酶也相继被发现。研究发现，大部分微生物β
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淀粉酶最适温度一般在40
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50℃，最适pH为6.5
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8.0。工业生产中，为减少污染杂菌，淀粉糖化过程尽可能在60℃以上进行。然而已有大部分微生物β
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淀粉酶热稳定性难以满足淀粉糖化过程在高温条件下的应用需求。
[0004]上述缺陷均使得现有的β
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淀粉酶无法很好的用于麦芽糖的工业化生产。因此，亟需得到一种热稳定性更高的β
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淀粉酶。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术的问题，本专利技术提供一种高稳定性的β
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淀粉酶突变体。
[0006]为达此目的，本专利技术第一提供一种β
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淀粉酶突变体，是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型β
‑
淀粉酶的第180位、第185位、第335位、第337位氨基酸中的一个或多个位点进行突变得到。
[0007]进一步优选的，所述突变体为以下a
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d中任一或多个组合：
[0008]a.将野生型β
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淀粉酶的第180位的丙氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酸或脯氨酸，将突变体命名为Ala180Asn，Ala180Glu，Ala180Pro，；
[0009]b.将野生型β
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淀粉酶的第185位的甘氨酸突变为天冬酰胺或赖氨酸或丝氨酸，将突变体命名为Gly185Asn，Gly185Lys，Gly185Ser；
[0010]c.将野生型β
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淀粉酶的第335位的缬氨酸突变成精氨酸或天冬氨酸或丝氨酸，将突变体命名为Val335Ser，Val335Arg，Val335Asp；
[0011]d.将野生型β
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淀粉酶的第337丝氨酸突变为组氨酸或赖氨酸，将突变体命名为Ser337His，Ser337Lys。
[0012]作为本专利技术的优选方案，所述β
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淀粉酶突变体是将野生型β
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淀粉酶的第180位的丙氨酸突变成天冬氨酸、将第185位的甘氨酸突变成天冬氨酸、将第335位的缬氨酸突变成丝氨酸、同时将第337丝氨酸突变成组氨酸得到的。在本专利技术中，将上述方案得到的β
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淀粉酶叠加突变体命名为Ala180Asn+Gly185Asn+Val335Ser+Ser337His。
[0013]进一步优选的，所述β
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淀粉酶突变体具有如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。
[0014]本专利技术第二提供所述β
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淀粉酶突变体的基因序列，其具有如SEQ ID No:4所示的核苷酸序列。
[0015]本专利技术第三提供一种携带所述基因序列的重组质粒；
[0016]进一步优选的，所述重组质粒的载体为pET载体、pGEX载体、pPICZ载体、pAN载体或pUB载体。
[0017]所述重组质粒采用如下步骤的方法制备而成：以插入野生型β
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淀粉酶基因序列的载体为模板，分别采用第180位氨基酸的引物SEQ ID No:5和引物SEQ ID No:6，以及引物SEQ ID No,7和引物SEQ ID No:8，以及引物SEQ ID No:9和引物SEQ ID No:10；第185位氨基酸的引物SEQ ID No:11和引物SEQ ID No:12，以及引物SEQ ID No:13和引物SEQ ID No:14，以及引物SEQ ID No:15和引物SEQ ID No:16；第335位氨基酸的引物SEQ ID No:17和引物SEQ ID No:18，以及引物SEQ ID No:19和引物SEQ ID No:20，以及引物SEQ ID No:21和引物SEQ ID No:22；第337位氨基酸的引物SEQ ID No:23和引物SEQ ID No:24，以及引物SEQ ID No:25和引物SEQ ID No:26；分别进行定点突变，获得含有单突变的重组质粒(即突变体质粒)。
[0018]作为本专利技术的优选方案，所述重组质粒采用包括如下步骤的方法制备而成：以含有野生型β
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淀粉酶基因序列的载体为模板，采用第180位氨基酸的引物SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β
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淀粉酶突变体，其特征在于，是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型β
‑
淀粉酶的第180位、第185位、第335位、第337位氨基酸中的一个或多个位点进行突变得到。2.如权利要求1所述的β
‑
淀粉酶突变体，其特征在于，所述突变体为将野生型β
‑
淀粉酶的第180位的丙氨酸突变成天冬氨酸、将第185位的甘氨酸突变成天冬氨酸、将第335位的缬氨酸突变成丝氨酸、同时将第337丝氨酸突变成组氨酸得到的。3.如权利要求2所述的一种β
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淀粉酶突变体，其特征在于，具有如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。4.编码权利要求1
‑
3任一项所述β
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淀粉酶突变体的基因，具有如SEQ ID No:4所示的核苷酸序列。5.携带权利要求4所述基因的重组质粒。6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET载体、pGEX载体、pPICZ载体、pAN载体或pUB载体。7.表达权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：楼志华，刘翔，张劲楠，
申请(专利权)人：江苏省奥谷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：