一种饲用α淀粉酶的突变改良方法及应用技术

本发明专利技术公开了L型α淀粉酶变体及其应用。所述的α淀粉酶变体由亲代α淀粉酶氨基酸序列中依次将四个氨基酸残基突变，仍然保持了亲代水解α

【技术实现步骤摘要】
一种饲用
α
淀粉酶的突变改良方法及应用


[0001]本专利技术属于酶工程领域，涉及α淀粉酶变体。

技术介绍

[0002]α
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淀粉酶是动物饲料中常用的—种淀粉酶,它以随机方式水解淀粉分子中的α
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1,4糖苷键,是一种内切型淀粉酶,水解效率较高。α
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淀粉酶虽然对淀粉分子链内部的α
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1,4糖苷键具有良好的水解作用,却不能水解支链淀粉分支点处的α
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1，6糖苷键和紧靠α
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1,6糖苷键的α
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1,4糖苷键,但能跨越α
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1,6糖苷键而继续切开支链内部的α
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1,4糖苷键。因此,α
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淀粉酶作用于直链淀粉时,其终产物是麦芽糖和葡萄糖；作用于支链淀粉时,其终产物除麦芽糖和葡萄糖外,还有α
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极限糊精。由于该酶作用于淀粉时所产生的葡萄糖残基C1碳原子为α
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构型,故称α
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淀粉酶。
[0003]饲料中使用的α
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淀粉酶有细菌α
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淀粉酶和真菌α
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淀粉酶两种,枯草芽孢杆菌BF7658α
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淀粉酶是我国工业化深层发酵生产的第一个微生物酶制剂,也是目前饲料中普通使用的淀粉酶:该酶是一种中温α
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淀粉酶,最适作用温度较高。真菌α
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淀粉酶主要由霉菌发酵产生,因其最适作用温度较中温α
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淀粉酶低20～30℃，亦称为低温α
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淀粉酶。
[0004]在本专利技术中，为适应饲料行业发展的需要，我们利用B.velezensisα
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amylase为模板构建了一系列新的α
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淀粉酶突变体，提高了该酶种的应用效率与体外酶解蛋鸡饲料的效率。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种B.velezensisα
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淀粉酶变体，该系列变体可以提高淀粉酶的耐酸性，并能应用于饲料行业。特别是在pH为2.5～2.8的条件下。
[0006]本专利技术的目的是提供编码该α淀粉酶变体的基因。
[0007]本专利技术的又一目的是提供该α淀粉酶变体的生产方法和应用。
[0008]本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：
[0009]一种α淀粉酶变体，是通过B.velezensis的α淀粉酶蛋白序列的第546、572、614、622号位突变，分别为由脯氨酸突变为谷氨酸,组氨酸突变为天冬氨酸,丙氨酸突变为谷氨酸,赖氨酸突变为谷氨酸。
[0010]所述的B.velezensis的α淀粉酶的全长编码基因序列见SEQ ID NO.1；对应的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。
[0011]所述的α淀粉酶变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。
[0012]所述的α淀粉酶变体的核苷酸编码序列优选自如SEQ ID NO.3所示。
[0013]用于表达本专利技术所述的α淀粉酶变体的表达载体，其中含有本专利技术所述的编码α淀粉酶变体的基因。
[0014]一种本专利技术所述的α淀粉酶变体的生产方法，包括在适宜α淀粉酶变体表达的条件下对含有编码α淀粉酶变体基因序列的重组子进行培养，并从重组子或者其培养上清液中
获得α淀粉酶变体。
[0015]本专利技术所述的α淀粉酶变体在水解多糖的α
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1,4糖苷键中的应用；优选在高温和/或低pH条件下水解多糖的α
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1,4糖苷键中的应用；所述的高温优选40℃～100℃；所述的低pH优选2.5～5.5。
[0016]有益效果
[0017]本专利技术提供的一种新的α淀粉酶变体，在pH2.5
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5.5酸性条件下和80℃以上高温条件下有较高的催化活度。本专利技术提供的α淀粉酶变体在体外酶解蛋鸡饲料时，效果均优于原淀粉酶。这些α淀粉酶变体具有良好的耐酸性、热稳定性，以及优良的饲料酶解效果，可用于动物饲料行业。
附图说明
[0018]图1为pET
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28a载体，包括一个卡那霉素决定基因(ErmC)——在E.coli中可以耐受100μg/mL的卡那霉素。
[0019]图2为pET
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28a
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amy载体的示意图。
[0020]图3淀粉酶在BL21(DE3)表达菌株中表达情况以及纯化后的SDS
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PAGE图。
[0021]图4为不同底物(玉米淀粉)浓度下，淀粉酶活力比较
[0022]图5为在不同pH条件下，40℃下保温两小时，淀粉酶活力比较
[0023]图6为在pH4.5时，不同温度下保温两小时，淀粉酶活力比较
[0024]图7为在pH2.7时，41℃，摇床转速为180rpm时，不同加酶量、不同添饲量、不同酶解时间下体外酶解蛋鸡饲料的比较
[0025]本专利技术的详细描述
[0026]本专利技术中，α淀粉酶指的是能够水解多糖的α
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1,4糖苷键的酶。例如，α淀粉酶能将淀粉水解成糊精。
[0027]本专利技术中，亲代α淀粉酶是指天然的α淀粉酶。天然的α淀粉酶是细菌α淀粉酶，来源包括但不局限于Bacillus subtilis,B.licheniformis，B.amyloliquefaciens，G.stearothermophilus和Bacillus cereus。
[0028]根据本专利技术的创新，天然α淀粉酶是来源于B.velezensis(本实验室从玉米籽粒中分离得到)的全长编码序列见SEQ ID NO.1；对应的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。
[0029]本专利技术中，术语“α淀粉酶变体”是指非天然存在的，在亲代的α淀粉酶氨基酸序列的有效点位进行一个或数个氨基酸残基的增加、删除和/或替代，同时仍然保持了亲代水解α
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1,4糖苷键的能力的α淀粉酶。
[0030]本专利技术中“液化”一般是指将碳水化合物分解为小分子的多糖的过程。当加入α淀粉酶或者α淀粉酶变体时，“液化”特指水解碳水化合物的α
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1,4糖苷键。
[0031]本专利技术中，“α
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1,4糖苷键”指将前一个葡萄糖的C1与后一个葡萄糖的C4连接起来的键，即为α
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1,4糖苷键。
[0032]本专利技术涉及将亲代α淀粉酶做序列改造获得的“α淀粉酶变体”。亲代α淀粉酶是天然的α淀粉酶，特别来源于细菌的天然α淀粉酶。根据本专利技术的实施例，α淀粉酶变体是将亲代的α淀粉酶的氨基酸序列的有效点位进行一个或数个氨基酸残基的突变、增加或删除。
[0033]本专利技术包括一系列的α淀粉酶变体。根据本专利技术的实施例，这一系列的α淀粉酶变
体的氨基酸序列的同源性至少达到95％。作为说明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种α淀粉酶变体，其特征在于所述的α淀粉酶变体是通过在贝莱斯芽孢杆菌D1(Bacillus velezensis D1，本实验室从玉米籽粒中分离得到)的α淀粉酶蛋白序列的第546、572、614、622号位依次突变，分别为由脯氨酸突变为谷氨酸,组氨酸突变为天冬氨酸,丙氨酸突变为谷氨酸,赖氨酸突变为谷氨酸，且所述的α淀粉酶变体仍保持了亲代α淀粉酶水解α
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1,4糖苷键的能力。2.根据权利要求1所述的α淀粉酶变体，其特征在于所述的α淀粉酶变体的原核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求2所述的α淀粉酶变体，其特征在于所述的α淀粉酶变体的原氨基酸编码序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。4.编码权利要求1～3中任一项所述的α淀粉酶变体的基因。5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于α淀粉酶变体核苷酸序列如序列表...

【专利技术属性】
技术研发人员：王在贵，胡倩，吴奇，孙振，孙锋，崔经纬，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：