一种嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B、编码基因及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其编码基因的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；制备方法依次按照如下步骤进行：将如SEQ ID NO.3所示的基因构建到pPICZαA真核表达载体上，在大肠杆菌DH5α中扩增培养，提取质粒并用SacI进行线性化，胶回收线性化产物并电击转化至毕赤酵母X

【技术实现步骤摘要】
一种嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B、编码基因及制备方法


[0001]本专利技术属于基因工程和遗传工程领域，尤其涉及一种嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B、编码基因及制备方法。

技术介绍

[0002]果胶是一种结构复杂的高分子量碳水化合物聚合物，作为结构多糖广泛存在于植物细胞壁中，并与纤维素、半纤维素和木质素相互交联形成致密的网状结构，在食品、饲料、造纸、纺织和果胶废液处理等众多工业生产中需要将果胶降解去除。
[0003]果胶多糖主链主要是通过D
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GalA的O
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1和O
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4位置通过α
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1, 4
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糖苷键相连，即同聚半乳糖醛酸，其约占果胶的70 %。采用糖苷水解酶28家族（GH28）的多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase, PG)通过水解方式可使果胶主链中的α
‑
1, 4
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糖苷键断裂，进而使高度聚合的果胶发生解聚。根据NCBI和CAZy数据库统计，已经注册的PG达到9000多条，其中有近200种PG从细菌和真核生物中克隆和表征，但最适温度主要集中在30~60℃。
[0004]多年以来，人们积极挖掘嗜热耐高温的PG，如Thermotoga maritima PelB（TM0437），最适温度80℃；土壤宏基因组样品（PecJKR01）最适温度70℃；Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725（CbPelA，最适温度72℃）；Neosartorya fischeri P1（Nf PG5）最适温度70 ℃；Penicillium occitanis （PG1）最适温度70℃；Penicillium oxalicum CZ1028（EPG4）最适温度70℃；Bispora sp. MEY
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1 （BiPG28A）最适温度70℃和Talaromyces leycettanus JCM12802（TlPGA、TePG28a和TePG28b）最适温度70℃。这些PG虽为嗜热酶但并不耐高温，即酶活性最高时的温度（最适温度）至少为70℃，但在大于60℃的高温环境中会在短时间内失去催化酶活性，无法满足在饲料、造纸及纺织等有高温需求的工业上应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B、编码基因及制备方法。
[0006]本专利技术的技术解决方案是：一种嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]一种如权利要求1所述嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B的编码基因，其特征在于：DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]一种如权利要求1所述嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：将如SEQ ID NO.3所示的基因构建到pPICZαA真核表达载体上，在大肠杆菌DH5α中扩增培养，提取质粒并用SacI进行线性化，胶回收线性化产物并电击转化至毕赤酵母X
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33感受态细胞中，之后涂布在含100 μg/mL博来霉素的固体YPDSZ培养基上，30℃培养5天；挑选平板上的单菌落菌株划含300 μg/mL博来霉素的YPD固体培养基培
养，挑取单菌落菌株进行诱导表达和纯化，获得获得氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的重组嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B。
[0009]本专利技术的多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B不仅嗜热耐高温，而且还具有宽泛的的pH耐受性，其酶活性最高时的温度（最适温度）为60℃；在60℃热处理2 h后，仍可以保留30 %以上的相对酶活力，在100℃热处理60 min仍有酶活性；在pH 2.0~11.0时相对酶活性保持在90%以上。可满足中低温甚至大于60℃的高温环境下酶解果胶之需要。
附图说明
[0010]图1是本专利技术实施例嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B诱导表达96 h纯化后的SDS
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PAGE电泳图。
[0011]图2是本专利技术实施例的嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B的温度影响活性曲线示意图。
[0012]图3是本专利技术实施例的嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B的pH影响活性曲线示意图。
[0013]图4是本专利技术实施例的嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B的温度稳定性示意图。
[0014]图5是本专利技术实施例的嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B的pH稳定性示意图。
[0015]图6是本专利技术实施例的嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B的酶动力学拟合曲线图。
[0016]图7是本专利技术实施例的嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B对聚半乳糖醛酸降解产物的ESI
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MS分析图。
具体实施方式
[0017]本专利技术是将来源于拉斯坦毛霉（Mucor lusitanicus）的基因序列采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool (BLAST )分析，DNAMAN软件进行多序列比对，Vector NTI分析序列信息。加His标签和密码子优化，人工合成获得如SEQ ID NO.3所示的基因，属于糖苷水解酶第28 家族（GH28）。该基因编码区长1098bp，单链，序列从第1
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1077位为编码嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B的DNA序列（如SEQ ID NO.2所示），1078
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1098位为His
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Tag标签和终止密码子的DNA序列。将该基因序列构建到pPICZαA真核表达载体上，在大肠杆菌DH5α中扩增培养，提取质粒并用SacI进行线性化，胶回收线性化产物并电击转化至毕赤酵母X
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33感受态细胞中，之后涂布在含100 μg/mL博来霉素的固体YPDSZ培养基上，30℃培养5天；挑取平板上的单菌落菌株划含300 μg/mL博来霉素的YPD固体培养基培养，进行高浓度抗生素筛选，挑取单菌落生长较大的菌株进行按毕赤酵母表达手册方法进行诱导表达。
[0018]诱导表达96h后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳图结果如图1所示，嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B在电泳胶上呈现单一条带，分子量约为38 kDa。最后将菌体破碎、裂解、纯化，收集纯化液，即获得重组表达的嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B。氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，从氨基端开始的第1
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365位氨基酸残基序列，单链，其中1
‑
359位为具有嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B活性的氨基酸序列（如SEQ ID NO.1所
示），360
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365位为His
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2. 一种如权利要求1所述嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B的编码基因，其特征在于：DNA序列如SEQ ID NO.2所示。3. 一种如权利要求1所述嗜热耐高温多聚半乳糖醛酸酶MlPG28B的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：将如SEQ ID NO.3所示的基因构建到pPICZαA真核表达载体上，在大肠杆菌DH...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨国军，刘思仪，田林芳，丛玉婷，王连顺，卢亚楠，王丽，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：