一种抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶及其制备方法、酶切工艺技术

本发明专利技术公开一种抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶及其制备方法、酶切工艺，本发明专利技术首次将透明质酸结合蛋白编码基因和水蛭透明质酸水解酶编码基因在酵母中进行融合表达获得新型透明质酸融合酶。所述透明质酸结合蛋白与水蛭透明质酸水解酶通过由9个甘氨酸和丝氨酸的重复氨基酸序列形成的Linker连接，并融合有6个组氨酸序列作为标签。本发明专利技术新型透明质酸融合酶，其透明质酸结合蛋白部分可与底物透明质酸特异性结合，利于透明质酸水解酶部分的功能发挥，解决了透明质酸酶催化反应存在的反馈抑制问题，显著提高了酶切效率，具有良好的工业生产价值及经济价值。生产价值及经济价值。生产价值及经济价值。

【技术实现步骤摘要】
一种抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶及其制备方法、酶切工艺


[0001]本专利技术属于生物
，涉及透明质酸水解酶，尤其涉及一种抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶及其制备方法、酶切工艺。

技术介绍

[0002]透明质酸（hyaluronic acid, HA），又称玻尿酸，是一种以D
‑
葡萄糖醛酸（GlcA）和N
‑
乙酰葡萄糖胺（GlcNAC）为双糖单位聚合而成的酸性粘多糖。D
‑
葡萄糖醛酸和N
‑
乙酰葡萄糖氨基之间由β
‑
1,3
‑
糖苷键连接，双糖单位之间由β
‑
1,4
‑
糖苷键连接。商品化的HA常以钠盐的形式存在，为白色粉末状或纤维状固体状，有较强的吸湿性能，吸附的水分可达其自身重量的1000倍。透明质酸寡糖（hyaluronan oligosaccharides, o
‑
Has）是指由HA降解形成的，相对分子质量小于10KDa的寡聚糖，包括透明质酸四糖（o
‑
Ha4）、透明质酸六糖（o
‑
Ha6）、透明质酸八糖（o
‑
Ha8）、透明质酸十糖（o
‑
Ha10）等。据报道，透明质酸寡糖能够刺激内皮细胞增值和扩散，促进Ⅰ型胶原蛋白和
Ⅷ
型胶原蛋白的再生，从而促进血管的生成；同时，透明质酸寡糖能够刺激内皮细胞识别创面信号，从而对伤口进行保护和修复，起到促进伤口愈合的作用；还有报道称，透明质酸寡糖还可以增强免疫调节，起到抑制特定肿瘤细胞增殖的作用；因此，o
‑
Has也越来越引起关注。
[0003]与工业化生产透明质酸的成熟工艺相比，低分子量透明质酸的制备工艺尚处于优化与改进阶段。目前，低分子量透明质酸的制备方法主要有物理降解法、化学降解法和酶切法。然而，物理降解法很难将透明质酸的分子量降解到10KDa以下，化学降解法很容易与透明质酸糖链上的基团发生化学反应使其丧失生物活性，因此，透明质酸寡糖的制备只适宜用酶切法进行。透明质酸酶（hyaluronidase，HAase）是1928年Duran
‑
Reynals首次从哺乳动物卵巢中提取得到，后陆续被发现更多的种类。根据HAase水解HA的机制不同HAase被分为3类，分别是牛睾丸型HAase、水蛭型HAase和微生物型HAase。现阶段商品化的透明质酸酶主要以牛睾丸组织提取制备的牛睾丸型HAase为主，但该产品质量差，价格昂贵且具有动物免疫源感染风险。而且现有的透明质酸水解酶还均具有一个严重的缺陷，其底物亲和力低，随着酶切的深入，透明质酸分子量的降低，透明质酸水解酶与底物的结合常数降低，酶切速率下降，这种现象也称为酶切底物的反馈抑制，这严重限制了透明质酸的彻底酶切及高纯度透明质酸寡糖的制备和生产。
[0004]因此，如何解决透明质酸酶催化反应存在的底物反馈抑制问题，提高酶切效率，提高透明质酸寡糖的产率，成为亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]针对上述提出的问题，本专利技术提供一种抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶及酶切工艺，以酿酒酵母为宿主，将透明质酸结合蛋白与水蛭透明质酸酶进行融合表达，所得融合蛋白酶用于大分子透明质酸酶切，获得透明质酸寡糖，主要是o
‑
Ha4，解决了透明质酸酶酶
切底物抑制的问题，显著提高了酶切效率，大幅提高了酶切终产物透明质酸四糖的产率。具体技术方案如下：首先，本专利技术提供一种抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶，该新型透明质酸融合酶是将透明质酸结合蛋白基因和透明质酸水解酶基因重组后导入酵母中进行融合表达获得；所述透明质酸结合蛋白为透明质酸结合蛋白TSG
‑
6，所述透明质酸水解酶为水蛭透明质酸水解酶，其二者的基因序列通过由9个甘氨酸和丝氨酸的重复氨基酸序列形成的氨基酸短肽Linker连接，且所述Linker的氮端融合有6个组氨酸序列作为标签。
[0006]前述的抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶，所述新型透明质酸融合酶的基因序列如SEQ ID NO：1所示，共1833bp。
[0007]其次，本专利技术还提供一种抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶的制备方法，包括如下步骤：S1：构建融合酶基因序列：在透明质酸结合蛋白TSG
‑
6的基因序列和水蛭透明质酸水解酶的基因序列中插入氨基酸短肽Linker基因序列，并融合标签序列，得到如SEQ ID NO：1所示的新型透明质酸融合酶的基因序列；所述氨基酸短肽Linker为9个甘氨酸和丝氨酸的重复氨基酸序列，如SEQ ID NO：5所示；所述标签序列为编码6个组氨酸的基因序列；S2：质粒重组：将酵母质粒进行HindIII单酶切得到线性质粒，并使用含该线性质粒两端同源序列的引物进行PCR扩增构建的新型透明质酸融合酶的基因序列；然后将扩增后的新型透明质酸融合酶基因、HindIII单酶切得到的酵母线性质粒与T5核酸外切酶、Phusion聚合酶及Taq连接酶混合，并在50℃的条件下孵育1h，得到含有新型透明质酸融合酶基因序列的重组质粒；S3：发酵表达：将含有新型透明质酸融合酶基因序列的重组质粒导入酿酒酵母菌中，然后接种于YPD培养基中进行发酵融合表达，获得含有新型透明质酸融合酶的发酵液；S4：收集纯化：发酵表达结束后收集发酵液，并将发酵液离心取上清后进行滤膜过滤，最后利用50KDa的超滤离心管进行离心超滤，收集超滤截留液进行酶活检测；S5：酶活检测：将收集的超滤截留液进行采用平板扩散法或DNS法进行酶活检测，测得的新型透明质酸融合酶活性为1.0
×
106～1.5
×
106U/mL。
[0008]作为优选的技术方案的，步骤S2中，所述酵母质粒为酿酒酵母质粒pYES2.0；所述新型透明质酸融合酶的基因序列PCR扩增引物序列：上游引物F，如SEQ ID NO：2所示；下游引物R，如SEQ ID NO：3所示。
[0009]作为优选的技术方案的，步骤S3中，所述YPD培养基的具体组成为酵母提取物10g/L、氯化钠10g/L、葡萄糖20g/L；所述发酵表达具体过程包括如下子步骤：S3
‑
1：培养菌种：将导入重组质粒酿酒酵母菌接种于含50mL YPD培养基的500 mL三角瓶中，在28～32℃、180～240r/min的条件下培养20～24h，获得表达菌种子液；S3
‑
2：转接发酵：将表达菌种子液按照体积浓度5%～15%的接种量转接至含有3L YPD培养基的10L摇瓶中，继续在28～32℃，180～240r/min的条件下进行发酵；S3
‑
3：诱导表达：当发酵液中的酵母菌细胞密度达到一定时加入诱导剂，并于30℃的条件下诱导新型透明质酸融合酶表达。
[0010]作为进一步优选的技术方案的，步骤S3
‑
3中，所述加入诱导剂的发酵液中的酵母
菌细胞密度为10
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶，其特征在于：该新型透明质酸融合酶是将透明质酸结合蛋白编码基因和透明质酸水解酶编码基因在酵母中进行融合表达获得；所述透明质酸结合蛋白为透明质酸结合蛋白TSG
‑
6，所述透明质酸水解酶为水蛭透明质酸水解酶，其二者通过由9个甘氨酸和丝氨酸的重复氨基酸序列形成的Linker连接，且融合有6个组氨酸序列作为标签。2.根据权利要求1所述的抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶，其特征在于：所述新型透明质酸融合酶的基因序列如SEQ ID NO：1所示。3.一种抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：构建融合酶基因序列：在透明质酸结合蛋白TSG
‑
6的基因序列和水蛭透明质酸水解酶的基因序列中插入Linker序列，并融合标签序列，得到如SEQ ID NO：1所示的新型透明质酸融合酶的基因序列；所述Linker序列为如SEQ ID NO：5所示的编码9个甘氨酸和丝氨酸重复氨基酸序列的基因序列；所述标签序列为编码6个组氨酸的基因序列；S2：质粒重组：将酵母质粒进行HindIII单酶切得到线性质粒，并使用含该线性质粒两端同源序列的引物进行PCR扩增构建的新型透明质酸融合酶的基因序列；然后将扩增后的新型透明质酸融合酶基因、HindIII单酶切得到的酵母线性质粒与T5核酸外切酶、Phusion聚合酶及Taq连接酶混合，并在50℃的条件下孵育1h，得到含有新型透明质酸融合酶基因序列的重组质粒；S3：发酵表达：将含有新型透明质酸融合酶基因序列的重组质粒导入酿酒酵母菌中，然后接种于YPD培养基中进行发酵融合表达，获得含有新型透明质酸融合酶的发酵液；S4：收集纯化：发酵表达结束后收集发酵液，并将发酵液离心取上清后进行滤膜过滤，最后利用50KDa的超滤离心管进行离心超滤，收集超滤截留液进行酶活检测；S5：酶活检测：将收集的超滤截留液进行采用平板扩散法或DNS法进行酶活检测，测得的新型透明质酸融合酶活性为1.0～1.5*10
6 U/mL。4.根据权利要求3所述的抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述酵母质粒为酿酒酵母质粒pYES2.0；所述新型透明质酸融合酶的基因序列PCR扩增引物序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。5.根据权利要求3所述的抗反馈抑制的新型透明质酸融合酶的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述YPD培养基的具体组成为酵母提取物10g/L、氯化钠10g/L、葡萄糖20g/L；所述发酵表达具体过程包括如下子步骤：S3
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1：培养菌种：将导入重组质粒酿酒酵母菌接种于含50mL YPD培养基的500 mL三角瓶中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐林，金玉，徐念沁，徐松泉，鲁锦标，常开金，曹晶晶，戴超，
申请(专利权)人：南京天纵易康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：