【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球及其设计、制备工艺和应用。
技术介绍
1、ⅲ型胶原蛋白（typeⅲ collagen）是胶原蛋白家族中的一种亚型，它是人体结缔组织的一个重要组成部分，是一种结构蛋白，负责赋予皮肤、骨骼、肌肉和其他组织弹性和支撑性。现已证明，ⅲ型胶原蛋白水解物具有显著的抗氧化、抗高血压、降脂以及修复受损皮肤的生物活性，并具有其它高分子材料望尘莫及的生物组织相容性，因此被广泛的应用在医药和化妆品行业。
2、传统的胶原蛋白获取方式主要是通过从动物组织（例如牛、猪等动物的皮肤、骨骼或蹄等组织）中提取的方式获得。然而，动物源的胶原蛋白存在一些潜在风险。动物组织可能携带一些病原体，包括细菌、病毒和其他微生物，如果在提取和处理过程中不经过充分的杀菌和检测，这些病原体可能存在到最终的胶原蛋白产品中，如果使用这些胶原蛋白产品，可能导致患有相关疾病的风险，例如疯牛病等。另外，动物源的胶原蛋白还存在引发免疫反应或过敏反应，有些人对动物蛋白质过敏，对动物源的胶原蛋白制品过敏的人群，不适合使用。
3、基因工程技术是一种利用分子生物学和遗传学的方法，对生物体的基因进行修改或重新组合的技术。这一技术的发展使得重组ⅲ型人源化胶原蛋白被充分的开发和应用，这不仅可以规避动物源胶原蛋白潜在的风险，而且可确保生产过程符合安全和质量方面的要求。现有的重组ⅲ型人源化胶原蛋白，是从人类基因中克隆ⅲ型胶原蛋白编码基因，然后将其导入工程菌中发酵表达，再经纯化手段进行提取。研究显示，ⅲ型胶原蛋白的分子
4、蛋白质环化是将蛋白质的线性结构转化为环形结构的化学或生物学方法。通过环化，可以提高蛋白质的稳定性、抗降解性、生物活性等；同时还可创造新的蛋白质构象，以适应特定的研究或应用需求。常用的一种蛋白质环化方法，是通过引入linker酶将蛋白质的n-末端和c-末端连接起来，形成一个环状结构。例如，中国专利申请cn116888272a公开的多肽串联连接和环化的方法，通过使用具有asx特异性连接酶和环化酶活性的酶（即butelase-1、vypal2和oaaep1b）为蛋白质的串联连接和环化提供足够的正交性。然而，对于ⅲ型胶原蛋白而言，多余成分的引入会影响其原有的功能及活性，特别是在医药和化妆品领域，对重组ⅲ型人源化胶原蛋白的定义有着严格的要求，需无任何的外源插入基因或修饰基因，现有的酶连环化方法显然不适合其环化。
5、因此，如何实现重组ⅲ型人源化胶原蛋白的环化，提高其稳定性、抗降解性和生物活性的同时创造新的蛋白质构象，以更好的适应医药和化妆品行业的应用，仍是值得探讨的问题。
技术实现思路
1、针对上述提出的现有重组ⅲ型人源化胶原蛋白稳定性差容易被降解，及现有的蛋白质酶连环化方式不适应重组ⅲ型人源化胶原蛋白环化的问题，本专利技术提供一种创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球及其设计、制备工艺和应用。对ⅲ型人源化胶原蛋白基因序列进行设计和构建，并在剪切酶和环化酶进行剪切后环化，实现不引入任何的外源插入基因或修饰基因的情况下，获得创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球。具体技术方案如下：
2、首先，本专利技术的目的之一是提供一种创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球，该胶原蛋白微球为仅由氨基酸序列100%覆盖人天然iii型胶原蛋白氨基酸序列的肽段环化而成，其氨基酸序列如seq no.1所示。
3、gergapgfrgpagpngipgekgpagergapgpagprgergapgfrgpagpngipgekgpagergapgpagpr，seq no.1（72个氨基酸）。
4、前述的创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球，其粒径为7～8个纳米，具体是由两个氨基酸序列如seq no.2所示的肽段首尾相接环化而成。
5、gipgekgpagergapgpagprgergapgfrgpagpn，seq no.2（36个氨基酸）。
6、其次，本专利技术的目的之二是提供一种创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球的设计方法，对ⅲ型人源化胶原蛋白基因序列进行设计，并构建表达载体，采用tev剪切酶剪切和butelase连接酶环化，实现在不引入任何的外源插入基因或修饰基因的情况下，获得新型的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球。具体包括如下步骤：
7、s1：设计ⅲ型人源化胶原蛋白基因序列：
8、根据现有的人源ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列设计用于环化的ⅲ型人源化胶原蛋白基因序列，如seq no.3所示；
9、5'-ggcatccccggcgagaagggccccgccggcgagaggggcgcccccggccccgccggccccaggggcgagaggggcgcccccggcttcaggggccccgccggccccaaccacgtg-3'，seq no.3。
10、s2：构建表达载体：
11、选择pet28a质粒作为表达基础，以mbp-his6作为质粒标签，根据设计的ⅲ型人源化胶原蛋白序列设计特异性靶蛋白序列enlyfq，构建获得表达载体pet28a-mbp-his6-enlyfq。
12、s3：重组表达
13、将步骤s1中设计的ⅲ型人源化胶原蛋白基因插入步骤s2中构建的表达载体的特异性靶蛋白基因之后，获得含有目标蛋白基因的重组质粒；将该重组质粒转入工程菌中进行培养并诱导表达，获得目标蛋白，其氨基酸序列如seqno.4所示；
14、即：mbp-his6-enlyfq-gipgekgpagergapgpagprge本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球，其特征在于：该胶原蛋白微球为仅由氨基酸序列100%覆盖人天然III型胶原蛋白氨基酸序列的肽段环化而成，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球，其特征在于：该胶原蛋白微球的球粒径为7～8个纳米，其由两个氨基酸序列如SEQ NO.2所示的肽段首尾相接环化而成。
3.一种创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的设计方法，其特征在于：包括如下步骤：
4.一种创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：该工艺包括如下步骤：
6.根据权利要求4或5所述的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：所述工程菌为包括但不限于大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，酵母菌中的任意一种。
7.根据权利要求6所述的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：所述TEV剪切酶为将His-
8.根据权利要求7所述的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：所述Butelase连接酶，其基因序列如SEQ NO.7所示，并通过CRISPR/Cas9技术整合到工程菌的基因表达位点上进行表达获得。
9.一种创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：
10.根据权利要求9所述的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：该工艺包括如下步骤：
11.根据权利要求9或10所述的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：所述工程菌为包括但不限于大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，酵母菌中的任意一种。
12.根据权利要求11所述的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：所述TEV剪切酶基因为His-TEVp重组蛋白基因，其插入pET-21a载体形成重组质粒，再将该重组质粒与含有目标蛋白的重组质粒一同导入工程菌中进行表达。
13.根据权利要求12所述的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：所述Butelase连接酶基因的核苷酸序列如SEQ NO.7所示，其通过CRISPR/Cas9技术整合到工程菌的基因表达位点上进行表达。
14.根据权利要求4或9所述的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：发酵表达所用的培养基均为M9培养基，所用的诱导剂均为IPTG诱导剂，加入的诱导剂在培养体系中的浓度为0.1～1mM。
15.一种创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球的应用，其特征在于：权利要求1或2所述的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球，或权利要求3所设计的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球，或权利要求4或9所制备的创新空间结构的重组Ⅲ型人源化胶原蛋白微球，在制备止血材料、骨修复材料、皮肤修复材料或医疗器械中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球，其特征在于：该胶原蛋白微球为仅由氨基酸序列100%覆盖人天然iii型胶原蛋白氨基酸序列的肽段环化而成，其氨基酸序列如seq no.1所示。
2.根据权利要求1所述的创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球，其特征在于：该胶原蛋白微球的球粒径为7～8个纳米，其由两个氨基酸序列如seq no.2所示的肽段首尾相接环化而成。
3.一种创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球的设计方法，其特征在于：包括如下步骤：
4.一种创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：该工艺包括如下步骤：
6.根据权利要求4或5所述的创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：所述工程菌为包括但不限于大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，酵母菌中的任意一种。
7.根据权利要求6所述的创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：所述tev剪切酶为将his-tevp重组蛋白基因插入pet-21a载体获得重组质粒，再将该重组质粒导入工程菌表达获得。
8.根据权利要求7所述的创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球的制备工艺，其特征在于：所述butelase连接酶，其基因序列如seq no.7所示，并通过crispr/cas9技术整合到工程菌的基因表达位点上进行表达获得。
9.一种创新空间结构的重组ⅲ型人源化胶原蛋白微球的...
【专利技术属性】
技术研发人员：金玉，徐林，徐念沁，鲁锦标，张东武，徐松泉，常开金，刘谋治，蒋圆，
申请(专利权)人：南京天纵易康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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