【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种制备红细胞膜单克隆抗体的快速免疫制备方法。
技术介绍
1、单克隆抗体是由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
2、单克隆抗体技术的基本原理为：小鼠受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，产生相应的抗体，这一职能是由b淋巴细胞来承担的；肿瘤细胞在体外培养的条件下可以无限传代，是“永久”的细胞。把小鼠的骨髓瘤细胞与经免疫过的小鼠的脾细胞在聚乙二醇(peg)等方式的介导下发生融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，一方面可以分泌特定的抗体,另一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力,可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖,从而分泌大量单克隆抗体。
3、传统杂交瘤方式制备单克隆抗体来源稳定、后期易制备、产量高，是免疫检测分析和疾病早期筛查使用最为普遍的抗体。制备良好的小鼠杂交瘤单克隆抗体涉及很多技术环节，包括抗原的设计筛选、动物免疫、细胞融合筛选技术、抗体的纯化方法等，每一个技术环节都缺一不可，本专利技术主要涉及红细胞膜单克隆抗体的快速免疫制备等技术方面。
4、传统人红细胞膜单克隆抗体制备的免疫方式为，取人血红细胞抗凝处理之后，再经过pbs漂洗离心，然后与完全佐剂、不完全佐剂乳化混匀，历经3-8周的免疫时间，多次注射小鼠背部皮下或者腹腔。然后取小鼠脾细胞与sp2/0细胞融合，经过后续操作制备得抗人红细胞膜单克隆抗体。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种快速、高效的红细胞膜单抗新型研发方法，
2、本专利技术提供技术方案如下：
3、本专利技术改进红细胞膜单抗制备过程中的免疫方法，进行快速、高效的红细胞膜单抗新型研发方法的建立，包括如下步骤：
4、s1、取人血红细胞抗凝处理后，生理盐水漂洗离心，制备终浓度为1*10^7个/ml的红细胞稀释液；
5、s2、超声破碎红细胞稀释液，获得红细胞悬液；
6、s3、选择6-8周龄的雌性balb/c小鼠，进行分组饲养；
7、s4、完全佐剂与s2中红细胞悬液按1:1的体积比例充分乳化混匀，以150-300ul/只对小鼠进行皮下多点注射；
8、s5、初次免疫7天后，低渗溶血法粗提红细胞膜蛋白，制成5mg/ml红细胞膜蛋白溶液；
9、s6、小鼠尾静脉注射25-50ug红细胞膜蛋白；
10、s7、二次免疫5天后，处死小鼠，制备脾细胞悬液，并与终浓度为5mg/ml的红细胞膜蛋白孵育1-2天；
11、s8、隔天将脾细胞与sp2/0细胞按照5:1-10:1的比例充分混匀，在聚乙二醇(peg)的介导下发生融合；
12、s9、培养10天后，对融合细胞进行阳性筛选。
13、本专利技术筛选阳性率达到80-90％，而常规免疫操作融合仅达到40-50％。进一步的，根据s1中的操作步骤，取人血红细胞抗凝处理后，生理盐水漂洗离心3次，制备终浓度为1*10^7个/ml的红细胞稀释液。
14、进一步的，根据s2中的操作步骤，超声破碎红细胞稀释液，超声功率200w，超声4s，间隔8s，超声99次。
15、进一步的，根据s4中的操作步骤，完全佐剂与上述红细胞悬液按1:1的体积比例充分乳化混匀，以150-300ul/只对小鼠进行皮下多点注射。进一步的，根据s5中的操作步骤，初次免疫7天后，低渗溶血法粗提红细胞膜蛋白，制成5mg/ml红细胞膜蛋白溶液。
16、进一步的，根据s6中的操作步骤，小鼠尾静脉注射25-50ug红细胞膜蛋白。
17、进一步的，根据s7中的操作步骤，二次免疫5天后，处死小鼠，制备脾细胞悬液，并与终浓度为5mg/ml的红细胞膜蛋白孵育1-2天。进一步的，根据s8中的操作步骤，隔天将脾细胞与sp2/0细胞按照5:1-10:1的比例充分混匀，在聚乙二醇(peg)的介导下发生融合。进一步的，根据s9中的操作步骤，培养10天后，用elisa间接法对融合细胞进行阳性筛选。
18、本专利技术与传统方法的区别在于人血细胞的处理方式以及免疫部位不同；现有技术例如《抗人红细胞膜抗非凝集型单克隆抗体的研制及特性鉴定》中制备红细胞膜抗原中也对红细胞膜进行了超声处理，但是其是超声乳化细胞膜，是一种乳化方式，我们是直接超声细胞，然后用这个破碎液和佐剂用注射器上下吹打的方式进行乳化，常规免疫一般每次免疫都是背部、皮下，或者腹腔。我们每次免疫都换处理和免疫方法，先超声处理，后尾静脉注射红细胞膜蛋白，最后孵育。
19、有益效果：
20、(1)本专利技术中，通过超声破碎红细胞免疫小鼠，尾静脉注射红细胞膜蛋白，并与脾细胞悬液混合孵育培养，快速、高效制备红细胞膜单克隆抗体。
21、(2)本专利技术中，红细胞膜蛋白直接注入尾静脉，通过血液循环可以让抗原快速到达脾脏，更有利于b细胞快速分泌高特异性抗体。
22、(3)本专利技术中，红细胞膜蛋白与脾细胞直接孵育，可以让抗原直接刺激脾脏，更有利于b细胞分泌高特异性抗体。
23、(4)本专利技术中，免疫时间由常规3-8周缩短至15天左右，免疫过程中单只小鼠免疫细胞使用量由常规4*10^6-8*10^6个减少至2*10^6，提高血清抗体效价，降低实验成本。
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1.一种制备红细胞膜单克隆抗体的快速免疫方法，其特征在于：初免时超声破碎人血红细胞，与完全佐剂混匀免疫小鼠；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括下列步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中制备成终浓度为1*10^7个/ml的红细胞稀释液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中超声条件为超声功率200W，超声4S，间隔8S，超声99次。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中完全佐剂与红细胞悬液按1:1的体积比例混匀。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中以150-300ul/只对小鼠进行皮下多点注射。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中制成5mg/ml红细胞膜蛋白溶液。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(6)中免疫注射部位为尾静脉，且注射剂量为25-50ug。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中脾细胞与SP2/0细胞按照5:1-10:1的细胞数量比
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(9)中用ELISA间接法对融合细胞进行阳性筛选。
...【技术特征摘要】
1.一种制备红细胞膜单克隆抗体的快速免疫方法，其特征在于：初免时超声破碎人血红细胞，与完全佐剂混匀免疫小鼠；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括下列步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中制备成终浓度为1*10^7个/ml的红细胞稀释液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中超声条件为超声功率200w，超声4s，间隔8s，超声99次。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中完全佐剂与红细胞悬液按1:1的体积比例混匀。
6.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：李永刚，朱翠兰，
申请(专利权)人：南京京达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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