一种α-葡萄糖转苷酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种α

【技术实现步骤摘要】
一种
α
‑
葡萄糖转苷酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种α
‑
葡萄糖转苷酶突变体及其应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides，IMOs)是一类功能性低聚糖，由2～10个α
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1、6
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糖苷键连接的葡萄糖基组成，包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等主要功能成分。IMOs可促进双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌在人体肠道中的增殖，调节肠道菌群；有低热量值，促进胃肠蠕动，改善便秘和脂质代谢，防龋齿等功能，因此，IMOs被广泛用作益生素、食品添加剂和饲料成分。
[0003]目前，一般通过酶促转化的方法生产IMOs，利用α
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淀粉酶、β
‑
淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖苷酶从淀粉中催化生产，其典型的生产过程通常包括3个步骤：一是液化，其中淀粉被耐热α
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淀粉酶液化产生低聚糖和糊精；二是糖化，低聚糖和糊精被β
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淀粉酶和普鲁兰酶等糖化酶糖化；三是转糖基化，α
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葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)可催化葡萄糖从底物的非还原末端释放，并将葡萄糖基残基转移到非还原葡萄糖单位的6
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OH基团，产生IMOs。目前，商业α
‑
淀粉酶，β
‑
淀粉酶和普鲁兰酶等的研究及工业应用较为成熟，而工业上应用的α
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葡萄糖苷酶大多来源于黑曲霉(Aspergillus niger)，由于热稳定性差、反应速率不高和酶纯化及回收利用成本高等问题，限制了α
‑
葡萄糖苷酶在规模化生产IMOs上的应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决现有技术的不足，提供一种热稳定性提高的α
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葡萄糖苷酶突变体。
[0005]技术方案
[0006]一种α
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葡萄糖苷酶突变体，是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α
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葡萄糖转苷酶的第204位和/或第307位的氨基酸进行定点突变获得的，其中，将第204位的丝氨酸突变为亮氨酸，第307位的丙氨酸突变为谷氨酸，所述α
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葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；编码所述α
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葡萄糖转苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]上述α
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葡萄糖苷酶突变体用于生产低聚异麦芽糖的应用。
[0008]一种制备上述α
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葡萄糖苷酶突变体的方法：
[0009](1)以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为模板，根据突变的位点，设计定点突变引物，进行PCR扩增获得含有突变位点的基因，然后构建含有编码突变体基因的载体。
[0010](2)将含有编码突变体的基因载体转化到宿主细胞内。
[0011](3)对上一步构建的重组细胞进行筛选验证，获得阳性克隆，然后通过培养发酵产酶，离心收集细胞，利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，离心，获得α
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葡萄糖转苷酶突变体。
[0012]一种编码上述α
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葡萄糖苷酶突变体的基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。
[0013]一种携带上述基因的重组表达载体。
[0014]所述重组表达载体以pET
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28a(+)载体作为原始表达载体。
[0015]一种由上述重组表达载体转化得到的基因工程菌。
[0016]所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。所述大肠杆菌包括BL21(DE3)。
[0017]本专利技术的有益效果：
[0018]1)本专利技术在天然α
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葡萄糖转苷酶的基础上，通过理性设计，结合定点突变生物技术改造α
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葡萄糖转苷酶分子结构，分析了突变后残基对酶热稳定性的影响，并最终获得了稳定性提高的突变菌株(S204L、A307E和S204L/A307E)。
[0019]2)天然α
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葡萄糖转苷酶的半衰期为18.3h，本专利技术提供的α
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葡萄糖转苷酶突变体S204L(第204位的丝氨酸突变为亮氨酸)在65℃时半衰期达到37.4h，是天然α
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葡萄糖转苷酶的半衰期的2.06倍；α
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葡萄糖转苷酶突变体A307E(第307位的丙氨酸突变为谷氨酸)在65℃时半衰期达到28.6h，是天然α
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葡萄糖转苷酶的半衰期的1.56倍；S204L/A307E(第204位的丝氨酸突变为亮氨酸，第307位的丙氨酸突变为谷氨酸)在65℃时半衰期达到56.9h，是天然α
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葡萄糖转苷酶的半衰期的3.1倍。
[0020]3)本专利技术提供的α
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葡萄糖转苷酶突变体在热稳定显著提高的同时酶的活性不受影响。其中，在酶催化活性基本不变的情况下在65℃热处理40h后，突变体S204L(第204位的丝氨酸突变为亮氨酸)和A307E(第307位的丙氨酸突变为谷氨酸)以及组合突变体S207L/A307E分别保留49.1％，43.2％和91.2％的相对酶活，对照组则仅仅保留15.7％的相对酶活。
[0021]4)本专利技术所得的α
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葡萄糖转苷酶突变体比野生型更适合于催化麦芽糖生成低聚异麦芽糖的应用，更利于生产工艺的灵活性。
附图说明
[0022]图1为野生型α
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葡萄糖转苷酶及α
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葡萄糖转苷酶突变体纯酶液的SDS
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PAGE电泳图；
[0023]图2为65℃、pH7.0条件下孵育40h后野生型α
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葡萄糖转苷酶及其突变体的残留活性测试结果；
[0024]图3为65℃条件下野生型α
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葡萄糖转苷酶及α
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葡萄糖转苷酶突变体S204L、A307E、S204L/A307E的半衰期；
[0025]图4为野生型α
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葡萄糖转苷酶及α
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葡萄糖转苷酶突变体S204L、A307E、S204L/A307E在不同pH下的酶活；
[0026]图5为野生型α
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葡萄糖转苷酶及α
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葡萄糖转苷酶突变体S204L、307E、S204L/A307E在不同温度下的酶活。
具体实施方式
[0027]下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。下述实施例中，涉及的pET
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28a(+)载体购自Invitrogen；涉及的培养基及配方如下：
[0028]LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种α
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葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述α
‑
葡萄糖苷酶突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α
‑
葡萄糖转苷酶的第204位和/或第307位的氨基酸进行定点突变获得的，其中，将第204位的丝氨酸突变为亮氨酸，第307位的丙氨酸突变为谷氨酸，所述α
‑
葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；编码所述α
‑
葡萄糖转苷酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.权利要求1所述α
‑
葡萄糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建涛，张建波，李志敏，胡成才，王志，
申请(专利权)人：山东恒仁工贸有限公司，
类型：发明
国别省市：