一种海藻糖合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种海藻糖合酶突变体，属于基因工程技术领域。所述海藻糖合酶突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的海藻糖合酶的第201位和/或第351位的氨基酸进行定点突变获得的。本发明专利技术在天然海藻糖合酶的基础上，通过理性设计，结合定点突变生物技术改造海藻糖合酶分子结构，分析了突变后残基对酶热稳定性的影响，并最终获得了稳定性提高的突变菌株S201I、H351A及组合突变株S201I/H351A，本发明专利技术的海藻糖合酶突变体在热稳定显著提高的同时酶的活性不受影响，本发明专利技术的海藻糖合酶突变体比野生型更适合于催化麦芽糖生成海藻糖的应用，更利于生产工艺的灵活性。于生产工艺的灵活性。于生产工艺的灵活性。

【技术实现步骤摘要】
一种海藻糖合酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种海藻糖合酶突变体及其应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]海藻糖是近年来新兴的一种功能性甜味剂，在食品、医药等工业中具有广阔的应用前景，而海藻糖合酶是目前生物酶法工业化生产海藻糖最有效的酶，其可以高效异构麦芽糖生成海藻糖，该酶反应流程短，易调控，不需要消耗高能物质，一步反应就能获得海藻糖。因此，海藻糖合酶转化法是工业化生产海藻糖的有效方法，有着良好的应用前景。
[0003]目前，已报道的海藻糖合酶在生物催化过程中热稳定性较差，并且多是在非食品安全菌株中表达。因此，对海藻糖合酶进行分子修饰以提高其热稳定性并且在食品安全级菌株中表达具有重要的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决现有技术的不足，提供一种热稳定性提高的海藻糖合酶突变体。
[0005]技术方案
[0006]一种海藻糖合酶突变体，是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的海藻糖合酶的第201位和/或第351位的氨基酸进行定点突变获得的，将第201位的缬氨酸突变为异亮氨酸，命名为S201I；或将第351位的组氨酸突变为丙氨酸，命名为H351A；或是将第201位的缬氨酸突变为异亮氨酸，同时将第351位的组氨酸突变为丙氨酸，命名为S201I/H351A；编码所述海藻糖合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]上述海藻糖合酶突变体在制备海藻糖中的应用。
[0008]一种制备上述海藻糖合酶突变体的方法：
[0009](1)以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为模板，根据理性设计的位点，设计定点突变引物，进行PCR扩增获得含有突变位点的基因，然后构建含有编码突变体基因的载体；
[0010](2)将含有编码突变体的基因载体转化到宿主细胞内；
[0011](3)对步骤(2)构建的重组细胞进行筛选验证，获得阳性克隆，然后通过培养发酵产酶，离心收集细胞，利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，离心获得含有海藻糖合酶突变体的粗酶液。
[0012]本专利技术还提供了一种携带上述基因的重组表达载体。
[0013]进一步，所述重组表达载体以pET
‑
28a载体作为原始表达载体。
[0014]一种由上述重组表达载体转化得到的基因工程菌。
[0015]所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，所述大肠杆菌包括BL21(DE3)。
[0016]本专利技术的有益效果：
[0017]1)本专利技术在天然海藻糖合酶的基础上，通过理性设计，结合定点突变生物技术改造海藻糖合酶分子结构，分析了突变后残基对酶热稳定性的影响，并最终获得了稳定性提
高的突变菌株(S201I、H351A及组合突变株S201I/H351A)。
[0018]2)天然海藻糖合酶的半衰期为13.2min，本专利技术提供的海藻糖合酶突变体S201I/H351A在45℃时半衰期达到101.1min，是天然海藻糖合酶的半衰期的7.7倍；海藻糖合酶突变体S201I在45℃时半衰期达到37.4min，是天然海藻糖合酶的半衰期的2.8倍；海藻糖合酶突变体H351A在45℃时半衰期达到32.6min，是天然海藻糖合酶的半衰期的2.5倍。
[0019]3)本专利技术提供的海藻糖合酶突变体在热稳定显著提高的同时酶的活性不受影响。其中，在50℃热处理20min后，突变体S201I/H351A、S201I、H351A分别保留95.4％、70.1％、48.3％的相对酶活，对照组则仅仅保留18.6％的相对酶活。
[0020]4)本专利技术所得的海藻糖合酶突变体比野生型更适合于催化麦芽糖生成海藻糖的应用，更利于生产工艺的灵活性。
附图说明
[0021]图1为纯酶液经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
‑
PAGE)分析；
[0022]图2为野生型海藻糖合酶及海藻糖合酶突变体S201I、H351A、S201I/H351A在50℃条件下的半衰期测试结果；
[0023]图3为野生型海藻糖合酶及海藻糖合酶突变体S201I、H351A、S201I/H351A在不同pH下的酶活测试结果；
[0024]图4为野生型海藻糖合酶及海藻糖合酶突变体S201I、H351A、S201I/H351A在不同温度下的酶活测试结果。
具体实施方式
[0025]下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。下述实施例中，涉及的培养基及配方如下：
[0026]LB液体培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl。
[0027]LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加2％琼脂。
[0028]下述实施例中所涉及的检测方法如下：
[0029]海藻糖合酶酶活测定方法：取100μL浓度为300μg/mL的纯酶加入到含有300g/L的麦芽糖的50mM pH 7.5磷酸氢二钠
‑
磷酸氢二钠缓冲液的900μL反应体系中；于40℃水浴条件下反应10min，然后100℃沸水浴10min终止酶促反应，离心取上清，稀释到10mg/mL，利用HPLC检测反应溶液中海藻糖的含量。
[0030]酶活定义：定义在35℃、pH 7.0的条件下，每分钟催化麦芽糖生成lμmol海藻糖所需的酶量，为一个酶活单位U。
[0031]比酶活：定义为单位蛋白的酶活U/mg。
[0032]实施例1
[0033]构建含海藻糖合酶突变体的重组质粒：
[0034](1)含有野生型的海藻糖合酶pse的重组质粒的构建
[0035]化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的野生型的海藻糖合酶pse，与pET
‑
28a载体采用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶酶切后连接，制备得到重组载体pET
‑
28a
‑
pse。
[0036](2)含有突变体的重组载体的获得：
[0037]利用全质粒PCR技术，将步骤(1)制备得到的重组载体pET
‑
28a
‑
pse为模板进行定点突变，获得含有突变体基因的重组质粒pET
‑
28a
‑
pseS201I、pET
‑
28a
‑
pseL174T、pET
‑
28a
‑
pseH351A，pET
‑
28a
‑
pseR560S、pET
‑
28a
‑
pseL316S、pET
‑
28a
‑
pseLS201I/H351AE。
[0038]设计的引物序列如下：
[0039]S201I_F：AAAATCTCATTCCGCTGCAGGTCGACGTG
[0040]S201I_R：GCAGCGGAATGAGA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海藻糖合酶突变体，其特征在于，所述海藻糖合酶突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的海藻糖合酶的第201位和/或第351位的氨基酸进行定点突变获得的，将第201位的缬氨酸突变为异亮氨酸；或将第351位的组氨酸突变为丙氨酸；或是将第201位的缬氨酸突变为异亮氨酸，同时将第351位的组氨酸突变为丙氨酸；编码所述海藻糖合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.权利要求1所述海藻糖合酶突变体在制备海藻糖中的应用。3.一种编码权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建涛，张建波，马春艳，李志敏，林玉，房鸣，
申请(专利权)人：山东恒仁工贸有限公司，
类型：发明
国别省市：