重组人源岩藻糖基转移酶变异体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一组重组人源岩藻糖基转移酶变异体，通过对特定位点和片段进行替换、增减、或删除后，改变岩藻糖基转移活性，显著提高转移分子量大于100KD的含有鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP

【技术实现步骤摘要】
重组人源岩藻糖基转移酶变异体及应用


[0001]本专利技术涉及一种蛋白突变体，属于多肽


技术介绍

[0002]糖基化是碳水化合物与目标分子（通常为蛋白质和脂质）共价连接的过程，蛋白质分子的糖基化是最丰富的翻译后修饰之一，这种修饰具有多种功能，例如，参与蛋白质分子的正确折叠，调节蛋白质的热力学和动力学稳定性，参与分子间相互作用和细胞间粘附，参与免疫识别或者免疫逃逸。与DNA转录或蛋白质翻译不同，蛋白质的糖基化过程没有模板，是一种是酶促反应，供体分子通常是一种活化的核苷酸糖，在糖基转移酶的作用下，对受体位点（羟基或其它官能团）进行特异的糖缀合物的反应。岩藻糖作为糖蛋白中糖链的组成部分，广泛存在于各类细胞表面的质膜上。岩藻糖基转移酶是将L
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岩藻糖从GDP
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岩藻糖（鸟苷二磷酸岩藻糖）供体底物转移到受体底物的酶。据目前的各种文献报道，岩藻糖基转移酶的主要供体底物都是分子量比较小的GDP
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岩藻糖。在岩藻糖基转移酶的作用下，将岩藻糖苷转移至哺乳细胞糖蛋白蛋白N
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多糖上。人源的岩藻糖基转移酶一共有11种，分别为FUT1; FUT2; FUT3; FUT4; FUT5; FUT6; FUT7; FUT8; FUT9; FUT10; FUT11。岩藻糖转移酶属于II型一次跨膜蛋白，主要存在于高尔基体内。原核生物的岩藻糖基转移酶，目前经过验证的主要来自幽门螺杆菌（Helicobacter pylori），包括6条序列（Uniprot：http://www.cazy.org/GT10.html）。
[0003]细胞表面的分子决定了细胞如何与其它细胞以及周围环境相互作用。肿瘤的治疗性抗体例如抗
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CD20, 抗
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VEGFR等通过结合T淋巴细胞和NK细胞表面的FcgR，同时结合肿瘤细胞表面的抗原，使得T和NK细胞发挥肿瘤杀伤作用（ADCC）。受其启发，肿瘤免疫疗法近年来有了突变进展——嵌合抗原受体T细胞免疫疗法， Chimeric Antigen Receptor T
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Cell Immunotherapy （CAR
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T），其中Kymriah是第一款被美国批准用于治疗B细胞前体急性淋巴细胞白血病。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，其用生物技术把辨识癌细胞表面CD19抗原的CAR基因插到T细胞膜表面上，直接识别肿瘤细胞，激活T细胞进行肿瘤杀伤。但CAR
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T的技术工艺复杂，价格昂贵。类似CAR
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T这样的细胞工程的主要技术挑战是在不干扰细胞内源性功能的情况下赋予被操纵细胞新的特性。作为目前最常见和最稳健的细胞工程方法，首先受到技术复杂性和安全问题的限制，如原代细胞病毒转导效率的再现性不一致、CAR基因的异质表达水平，以及内源性基因被破坏的可能性。因此，使用化学生物学工具直接修饰细胞表面已成为细胞治疗的一种补充和普遍适用的方法。其中包括Bertozzi等人开发的代谢寡糖修饰法（MOE）和细菌转肽酶sortases催化的转肽反应。（Stephan,等.Nano Today 2011, 6, 309
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325.；Griffin等. Cell Chem. Biol. 2016, 23, 108
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121. ；Hudak等 Chem. Biol. 2014, 21, 16
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37. ；Bi, X等. Engineering. Chem.
ꢀ‑ꢀ
Eur. J. 2018, 24, 8042
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8050.））此外，Wu等利用幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶成功地将抗体类大分子蛋白转移到细胞膜表面的多糖上，例如LacNAc和α2,3 sialyl LacNAc。利用这种技术，Wu等构建了两种类型的工程细胞——使用自然杀伤细胞系（NK
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92MI）和小鼠原代CD8
+
OT
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1T细胞，
通过岩藻糖基转移酶将Her2抗体和PD
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L1的抗体分别转移至NK
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92MI和CD8
+
OT
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1T细胞，并在小鼠模型中展示了特异性肿瘤靶向性和对抗肿瘤细胞产生的抑制信号（参见Li J,等. ACS Cent Sci. 2018 Dec 26;4(12):1633
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1641. ）。因此，利用岩藻糖基转移酶将与供体底物相结合的目的分子标记到携带有受体底物的目的细胞将使得诸如CAR
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T这样的细胞治疗的效果得到大幅提升。
[0004]糖苷转移酶(glycotransferase)能够在中性条件下，尤其是哺乳细胞无损伤的反应条件下作用，对于细胞学工程是一个无以比拟的长处。但是无论是细菌来源的还是人源的岩藻糖基转移酶对于大分子的供体底物的酶活性并不好。本专利技术人在研究中发现，相比小分子GDP
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Fucose而言，岩藻糖基转移酶对于大分子的供体底物的酶活性降低近千倍，不能满足临床治疗的需求。因此，本专利技术的目的就是提供一种对于大分子的供体底物转移具有优异酶活性的岩藻糖基转移酶突变体。

技术实现思路

[0005]基于上述目的，本专利技术首先提供了一种重组人源岩藻糖基转移酶变异体，所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体在SEQ ID NO. 1所示的野生型氨基酸序列的第 109 氨基酸至第110氨基酸或者第 170 氨基酸至第171氨基酸的位置插入来源于幽门螺杆菌的alfa
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1,3岩藻糖基转移酶序列中较为宽松的序列SEQ ID NO. 7或者SEQ ID NO. 8，此处所述较为宽松的序列是指没有固定的二级结构的非保守性序列。
[0006]在一个优选的实施方案中，所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0007]在另一个优选的实施方案中，所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0008]其次，本专利技术提供了一种上述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的多核苷酸，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0009]在另一个可选择的实施方案中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.6所示。
[0010]第三，本专利技术提供了一种含有上述多核苷酸的表达载体。
[0011]第四，本专利技术提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。
[0012]在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞为HEK293细胞或者CHO细胞。
[0013]第五，本专利技术提供了一种应用上述的重组人源岩藻糖基转移酶变异体将靶分子标记于目的细胞或者目的蛋白质的方法，所述方法包括：（1）将供体底物与靶分子相缀合获得连接复合物；（2）在所述的重组人源岩藻糖基转移酶变异体存在的条件下，使步骤（1）获得的连接复合物与含有GlcNac受体分子的目的细胞或者本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组人源岩藻糖基转移酶变异体，其特征在于，所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体在SEQ ID NO. 1所示的野生型氨基酸序列的第 109 氨基酸至第110氨基酸或者第 170 氨基酸至第171氨基酸的位置插入如SEQ ID NO. 7或者SEQ ID NO. 8所示的序列。2.根据权利要求1所述的重组人源岩藻糖基转移酶变异体，其特征在于，所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的序列如SEQ ID NO. 3所示。3.根据权利要求1所述的重组人源岩藻糖基转移酶变异体，其特征在于，所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的序列如SEQ ID NO. 5所示。4.一种编码权利要求2所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO. 4所示。5.一种编码权利要求3所述重组人源岩藻糖基转移酶变异体的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.6所示。6.一种含有权利要求4或5所述多核苷酸的表达载体。7.一种含有权利要求6所述表达载体的宿主细胞。8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为H...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冀姝，黄滔，
申请(专利权)人：北京睿脉医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：