【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开了一种工程化细胞的制备方法，属于细胞工程领域。
技术介绍
1、cd8+t细胞和nk细胞是免疫系统的细胞毒性效应细胞，能够识别和杀伤感染或者恶变的细胞。在肿瘤治疗的临床实践上，通过各种策略刺激cd8+t细胞和nk细胞，以期达到消减肿瘤细胞的目的。例如使用细胞因子如白细胞介素（如il-2、il-12、il-15、il-18和il-21），可以增强cd8+t细胞和nk分化和激活。但是临床试验却显示出错综复杂的效果，除了与肿瘤类型和给药条件有关外，半衰期短，以及对非免疫细胞的作用而造成的潜在毒性是其治疗效果不理想的主要原因【2019-star review the challenges and molecularapproaches surrounding interleukin-2-based；2019-il 15 for cancer andautoimmune；2021-next-generation cytokines for cancer immunotherapy；2020-cancer-killing, decoy-resistant interleukin-18】。此外，免疫共刺激分子作为免疫细胞激活的第二信号，也进入临床试验阶段，包括cd27、cd40、ox40、gitr、icos等。例如4-1bb(cd137，肿瘤坏死因子受体超家族成员9)，属于肿瘤坏死因子受体蛋白家族，主要表达在各类免疫细胞表面，包括活化的t淋巴细胞（cd4 +和cd8 +）、nk、巨噬细胞、b细胞等。临床前研究表明，4-1bb信号的
2、嵌合抗原受体t细胞免疫疗法（car-t， chimeric antigen receptor t-cellimmunotherapy）是一种新型的工程t细胞过继治疗，可以通过识别肿瘤细胞，激活工程t细胞，进行肿瘤杀伤。但car-t的技术工艺复杂，价格昂贵。类似car-t这样的细胞工程的主要技术挑战是在不干扰细胞内源性功能的情况下赋予被操纵细胞新的特性。作为目前最常见和最稳健的细胞工程方法，首先受到技术复杂性和安全问题的限制，如原代细胞病毒转导效率的再现性不一致、car基因的异质表达水平，以及内源性基因被破坏的可能性。
3、使用化学生物学工具直接修饰细胞表面已成为细胞治疗的一种补充和普遍适用的方法。糖基化是碳水化合物与目标分子（通常为蛋白质和脂质）共价连接的过程，蛋白质的糖基化过程没有模板，是一种酶促反应，供体分子通常是一种活化的核苷酸糖，在糖基转移酶的作用下，对受体位点（羟基或其它官能团）进行特异的糖缀合物的反应。岩藻糖作为糖蛋白中糖链的组成部分，广泛存在于各类细胞表面的质膜上。岩藻糖基转移酶是将l-岩藻糖从gdp-岩藻糖（鸟苷二磷酸岩藻糖）供体底物转移到受体底物的酶。据目前的各种文献报道，岩藻糖基转移酶的主要供体底物都是分子量比较小的gdp-岩藻糖。在岩藻糖基转移酶的作用下，将岩藻糖苷转移至哺乳细胞糖蛋白n-多糖上。wu等利用幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶成功地将抗体类大分子蛋白转移到细胞膜表面的多糖上例如lacnac和α2,3sialyl lacnac。利用这种技术，wu等构建了两种类型的工程细胞−使用自然杀伤细胞系（nk-92mi）和小鼠原代cd8+ot-1t细胞，通过岩藻糖基转移酶将her2抗体和pd-l1的抗体分别转移至nk-92mi和cd8+ot-1t细胞，并在小鼠模型中展示了特异性肿瘤靶向性和对抗肿瘤细胞产生的抑制信号（参见li j,等. acs cent sci. 2018 dec 26;4(12):1633-1641. ）。因此利用岩藻糖基转移酶将与供体底物相结合的目的分子标记到携带有受体底物的目的细胞将使得诸如car-t这样的细胞治疗的效果得到大幅提升。该方法虽然是car-t以及免疫细胞过继疗法的有益补充，但仍然是高度定制化的疗法，受限于可获取的患者免疫细胞的数量，体外细胞扩增工艺复杂，操作程序成本高、耗时长，免疫细胞亚型分选的困难等导致价格昂贵；此外免疫细胞在体内半衰期短，容易被肿瘤微环境抑制，发生功能耗竭，使得实际应用受到限制。
4、鉴于现有技术存在的上述的技术缺陷，本专利技术的目的就是提供一种能够运用于肿瘤免疫治疗领域的新方法，以能够直接或者间接、有效、专一性高地激活机体内现存的nk细胞和cd8+t细胞，以区别于现有技术中高度定制化的细胞治疗（必须通过体外扩增增加nk和t细胞的数量，再回输给患者）。
技术实现思路
1、基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种将化学分子或者生物大分子偶联至成熟红细胞表面的方法，所述方法包括以下步骤：
2、（1）对化学分子或者生物大分子进行修饰通过共价键将gdp-岩藻糖衍生物偶联至化学分子或者生物大分子上；
3、（2）利用岩藻糖基转移酶酶促反应将步骤（1）获得的化学分子或生物大分子通过糖苷键共价结合至红细胞膜表面的多糖上。
4、本专利技术所述的gdp-岩藻糖衍生物，例如gdp-岩藻糖-（二苯并环）三氮唑-pegn (n=0~12)和gdp-岩藻糖-乳酸-羟基乙酸，均可以实现与化学分子或者生物大分子的偶联，在本专利技术的一个具体实施方案中，所述gdp-岩藻糖衍生物为鸟苷5′-二磷酸-岩藻糖-三氮唑-聚乙二醇-甲基四嗪（gdp-fucose-triazole-peg4-tz）。
5、在一个优选的技术方案中，所述化学分子选自治疗性分子或荧光基团。治疗性的小分子包括但不限于糖皮质激素类，例如，地塞米松，抗凝血药物，例如，华法令，抑制血小板聚集类药物，例如，氯吡格雷或替格瑞洛，血管紧张素系统抑制剂，例如卡托普利，以及抗心绞痛类的曲美他嗪; 荧光基团包括但不限于cy5，cy3。
6、在另一个优选的技术方案中，所述生物大分子选自多核苷酸、多肽或抗体。其中，多核苷酸包括但不限于含有cpg的单链寡核苷酸tccatgacgttcctgacgtt，tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt，cctggatgggaacttaccgctgc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种将化学分子或者生物大分子偶联至成熟红细胞表面的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学分子选自治疗性分子或荧光基团。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物大分子选自：多核苷酸、多肽、抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗体选自单克隆抗体、单链抗体、双特异性抗体、纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗体为抗4-1BB激活性抗体。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述生物大分子选自白细胞介素IL-15异构体或白细胞介素IL-12。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成熟红细胞取自外周血，去除血清以及其它血液细胞；红细胞悬浮液中无游离的蛋白质分子；红细胞悬浮液是新鲜制备或者在适当条件下储存30天以内。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖基转移酶为人源岩藻糖基转移酶或幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（2）中的所述岩藻糖基转移酶酶促反应的反应条件为: 红细胞密度为5×107/mL ~ 5×109/mL；岩藻糖基转移酶浓度为40 μg/mL~300 μg/mL；作为药物的大分子为抗体或Fc融合蛋白，浓度为60 μg/mL~120 μg/mL；反应温度为4摄氏度至37摄氏度；反应时间为20分钟至16小时。
11.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖基转移酶酶促反应为无Mg2+存在，其具有150mM 氯化钠、2.7mM氯化钾、44mM葡萄糖，pH 5.9-6.3的反应体系。
12.一种工程化红细胞，其特征在于，所述工程化红细胞是根据权利要求1-11任一所述方法制备而获得的。
13.权利要求12所述的工程化红细胞在制备肿瘤疾病治疗药物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述肿瘤疾病为结肠癌细胞或黑色素瘤。
...【技术特征摘要】
1.一种将化学分子或者生物大分子偶联至成熟红细胞表面的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化学分子选自治疗性分子或荧光基团。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物大分子选自：多核苷酸、多肽、抗体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗体选自单克隆抗体、单链抗体、双特异性抗体、纳米抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抗体为抗4-1bb激活性抗体。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述生物大分子选自白细胞介素il-15异构体或白细胞介素il-12。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成熟红细胞取自外周血，去除血清以及其它血液细胞；红细胞悬浮液中无游离的蛋白质分子；红细胞悬浮液是新鲜制备或者在适当条件下储存30天以内。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖基转移酶为人源岩藻糖基转移酶或幽门螺杆菌的岩藻糖基转移酶。
9.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：王冀姝，胡探宇，黄滔，
申请(专利权)人：北京睿脉医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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