【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
1.本专利技术总体上涉及分子生物学、医学和遗传学领域。更特别地，本专利技术涉及使用核苷酸编辑方法进行基因组编辑以在体内校正突变的组合物及其用途。
技术介绍
0、2.
技术介绍
1、心肌病是导致心肌变大、变厚和/或僵硬的心肌疾病。随着心肌病的进展，心脏变得更弱，并且可导致心力衰竭或心律不齐(即心律失常)。扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy，dcm)是严重的心肌疾病，以左心室或双心室扩大和收缩功能障碍为特征，代表心力衰竭的主要风险因素(1)。rna结合基序蛋白20(rna binding motif protein 20，rbm20)的突变是心肌病的常见原因，并且是2至5％家族性dcm患者的原因(2,3)。许多rbm20突变聚集在介导核定位的富含精氨酸/丝氨酸(arginine/serine rich，富含rs)的结构域内(4-7)。具有这些rbm20突变的患者经历高频率的心律失常事件和心源性猝死(8-10)。
2、rbm20调节许多编码肌节和钙调节蛋白的重要心脏基因的选择性剪接(7,11)。据推测，rbm20相关心肌病的主要原因是缺少心脏基因(例如肌联蛋白(titin，ttn))的选择性剪接(12)。然而，最近的报道表明，富含rs的区域中的rbm20r636s突变诱导了胞质中相分离核糖核蛋白(ribonucleoprotein，rnp)颗粒的形成和rbm2错误定位(13)，意味着心肌细胞(cardiomyocyte，cm)中的异常rnp颗粒是dcm的潜在原因(13-16)。由于大多数治疗
技术实现思路
1、精确的crispr-cas9基因编辑技术，例如碱基编辑(base editing，be)和先导编辑(prime editing，pe)，提供了永久校正致病突变的潜力，并提供了治疗心肌病的新的治疗方法(17,18)。为此，本专利技术人设计了sgrna以通过crispr-cas9腺嘌呤碱基编辑(adeninebase editing，abe)在人诱导多能干细胞来源的心肌细胞中校正rbm20(r634q)突变，并观察到了功能性心肌细胞的恢复。另外，本专利技术人创建了rbm20(r636q)小鼠模型，该模型表现出严重的心脏功能障碍和猝死，再现了在dcm患者中观察到的表型。使用腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)递送系统将abe基因编辑组分递送至小鼠以在体内挽救rbm20心肌病。本专利技术人还设计了用于先导编辑(pe)的pegrna，以校正不能被abe校正的其他rbm20突变。这些发现为永久校正rbm20突变和dcm潜在的其他遗传突变提供了有前景的治疗方法。
2、本公开内容至少部分地基于这样的发现：将指导rna(guide rna，grna)与成簇规律间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，crispr)/crispr相关蛋白9(cas9)系统一起使用，通过碱基对编辑校正遗传突变，成功逆转了与家族性心肌病(例如dcm)相关的表型。换言之，本公开内容涉及包含被设计用于crispr/cas9系统的单指导rna(single guide rna，sgrna)的组合物以及使用其用于预防、改善或治疗一种或更多种心肌病的方法。
3、本公开内容的一些方面提供了被设计用于crispr/cas9系统以用于预防、改善或治疗一种或更多种心肌病的grna。在一些实施方案中，本文中的grna可预防、改善或治疗一种或更多种心肌病，包括扩张型心肌病(dcm)。
4、在一些实施方案中，本文中的grna可包含与seq id no:1至4中任一个的核苷酸序列具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本文中的grna还可包含原间隔区相邻基序(protospacer adjacent motif，pam)。
5、在一个实施方案中，本文中提供了包含选自seq id no:1至4中任一个的靶向核酸序列的指导rna(grna)。靶向核酸序列可具有与seqid no:1至4中任一个至少85％相同、90％相同或95％相同的序列。grna可以是单分子指导rna(sgrna)。grna可用于修饰人rbm20基因中的序列。
6、在一些实施方案中，本文中的grna可以校正至少一种基因中的至少一种突变，其中所述至少一种基因包含rbm20。在一些实施方案中，本文中的grna可以校正rbm20基因中的r634q突变或其哺乳动物等同物。
7、本公开内容的另一些方面提供了crispr/cas9系统。在一些实施方案中，本文中的crispr/cas9系统可包含至少一种载体，所述载体包含编码cas9核酸酶的多核苷酸分子和至少一种如本文中公开的grna。在一些实施方案中，本文中的crispr/cas9系统可包含由链球菌属(streptococcus)、葡萄球菌属(staphylococcus)和/或其变体构成的cas9核酸酶。
8、在一个实施方案中，本文中提供了包含碱基编辑器和靶向人rbm20中的突变的grna的组合物。grna可包含选自seq id no:1至4中任一个的靶向核酸序列。靶向核酸序列可具有与seq id no:1至4中任一个至少85％相同、90％相同或95％相同的序列。grna可以是单分子指导rna(sgrna)。
9、碱基编辑器可以是腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor，abe)。碱基编辑器可包含与腺苷脱氨酶连接的crispr/cas核酸酶。crispr/cas核酸酶可以是催化受损的。crispr/cas核酸酶可以是可分离自或来源于酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的cas9核酸酶(例如，spcas9)。
10、在一个实施方案中，本文中提供了核酸，其包含：编码靶向人rbm20中的突变的第一grna的序列；编码碱基编辑器的序列；编码第一启动子的序列，其中第一启动子驱动编码第一grna的序列的表达；和编码第二启动子的序列，其中第二启动子驱动编码碱基编辑器的序列的表达。
11、grna可包含选自seq id no:1至4中任一个的靶向核酸序列。靶向核酸序列可具有与seq id no:1至4中任一个至少85％相同、90％相同或95％相同的序列。grna可以是单分子指导rna(sgrna)。碱基编辑器可以是腺嘌呤碱基编辑器(abe)。碱基编辑器可包含与腺苷脱氨酶连接的crispr/cas核酸酶。crispr/cas核酸酶可以是催化受损的。crispr/cas核酸酶可以是cas9核酸酶，所述cas9核酸酶可分离自或来源于酿脓链球菌(例如，spcas9)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(例如，sacas9)、耳葡萄球菌(staphyl本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.指导RNA(gRNA)，其包含选自SEQ ID NO:1至4中任一个的靶向核酸序列。
2.权利要求1所述的gRNA，其中所述gRNA是单分子指导RNA(sgRNA)。
3.权利要求1或2所述的gRNA，其中所述gRNA用于修饰人RBM20基因中的序列。
4.组合物，其包含碱基编辑器和靶向人RBM20中的突变的gRNA。
5.权利要求4所述的组合物，其中所述碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。
6.权利要求4所述的组合物，其中所述gRNA是权利要求1至3中任一项所述的gRNA。
7.权利要求6所述的组合物，其中所述碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。
8.权利要求4至7中任一项所述的组合物，其中所述碱基编辑器包含与腺苷脱氨酶连接的CRISPR/Cas核酸酶。
9.权利要求8所述的组合物，其中所述CRISPR/Cas核酸酶是催化受损的。
10.权利要求8或9所述的组合物，其中所述CRISPR/Cas核酸酶是Cas9核酸酶。
11.权利要求10所述的组合物
12.核酸，其包含：
13.权利要求12所述的核酸，其中所述碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。
14.权利要求12或13所述的核酸，其中所述碱基编辑器包含与腺苷脱氨酶连接的CRISPR/Cas核酸酶。
15.权利要求14所述的核酸，其中所述CRISPR/Cas核酸酶是催化受损的。
16.权利要求14或15所述的核酸，其中所述CRISPR/Cas核酸酶是Cas9核酸酶。
17.权利要求16所述的核酸，其中所述Cas9核酸酶分离自或来源于酿脓链球菌(spCas9)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SaCas9)、耳葡萄球菌(Staphylococcus auricularis)(SauCas9)或路邓葡萄球菌(Staphylococcuslugdunensis)(SlugCas9)。
18.权利要求12至17中任一项所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列和所述编码第二启动子的序列中的至少一个包含细胞类型特异性启动子。
19.权利要求18所述的核酸，其中所述细胞类型特异性启动子是心肌细胞特异性启动子。
20.权利要求19所述的核酸，其中肌肉特异性启动子是心肌肌钙蛋白T(cTnT)启动子。
21.权利要求12至20中任一项所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列包含编码U6启动子、H1启动子或7SK启动子的序列。
22.权利要求12至21中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含DNA序列。
23.权利要求12至22中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含RNA序列。
24.权利要求12至23中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含聚腺苷(polyA)序列。
25.权利要求24所述的核酸，其中所述polyA序列是微型polyA序列。
26.细胞，其包含权利要求12至25中任一项所述的核酸。
27.组合物，其包含权利要求12至25中任一项所述的核酸。
28.细胞，其包含权利要求27所述的组合物。
29.组合物，其包含权利要求28所述的细胞。
30.载体，其包含权利要求12至25中任一项所述的核酸。
31.权利要求30所述的载体，其中所述载体还包含编码转座元件的反向末端重复(ITR)的序列。
32.权利要求31所述的载体，其中所述转座元件是转座子。
33.权利要求32所述的载体，其中所述转座子是Tn7转座子。
34.权利要求33所述的载体，其中所述载体还包含编码T7转座子的5’ITR的序列和编码T7转座子的3’ITR的序列。
35.权利要求30至34中任一项所述的载体，其中所述载体是非病毒载体。
36.权利要求35所述的载体，其中所述非病毒载体是质粒。
37.权利要求30至34中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
38.权利要求37所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体或腺病毒载体。
39.权利要求38所述的载体，其中所述AAV载体是复制缺陷型或条件性复制缺陷型的。
40.权利要求38或39所述的载体，其中所述AAV载体是重组AAV载体。
4...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.指导rna(grna)，其包含选自seq id no:1至4中任一个的靶向核酸序列。
2.权利要求1所述的grna，其中所述grna是单分子指导rna(sgrna)。
3.权利要求1或2所述的grna，其中所述grna用于修饰人rbm20基因中的序列。
4.组合物，其包含碱基编辑器和靶向人rbm20中的突变的grna。
5.权利要求4所述的组合物，其中所述碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器(abe)。
6.权利要求4所述的组合物，其中所述grna是权利要求1至3中任一项所述的grna。
7.权利要求6所述的组合物，其中所述碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器(abe)。
8.权利要求4至7中任一项所述的组合物，其中所述碱基编辑器包含与腺苷脱氨酶连接的crispr/cas核酸酶。
9.权利要求8所述的组合物，其中所述crispr/cas核酸酶是催化受损的。
10.权利要求8或9所述的组合物，其中所述crispr/cas核酸酶是cas9核酸酶。
11.权利要求10所述的组合物，其中所述cas9核酸酶分离自或来源于酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)(spcas9)。
12.核酸，其包含：
13.权利要求12所述的核酸，其中所述碱基编辑器是腺嘌呤碱基编辑器(abe)。
14.权利要求12或13所述的核酸，其中所述碱基编辑器包含与腺苷脱氨酶连接的crispr/cas核酸酶。
15.权利要求14所述的核酸，其中所述crispr/cas核酸酶是催化受损的。
16.权利要求14或15所述的核酸，其中所述crispr/cas核酸酶是cas9核酸酶。
17.权利要求16所述的核酸，其中所述cas9核酸酶分离自或来源于酿脓链球菌(spcas9)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(sacas9)、耳葡萄球菌(staphylococcus auricularis)(saucas9)或路邓葡萄球菌(staphylococcuslugdunensis)(slugcas9)。
18.权利要求12至17中任一项所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列和所述编码第二启动子的序列中的至少一个包含细胞类型特异性启动子。
19.权利要求18所述的核酸，其中所述细胞类型特异性启动子是心肌细胞特异性启动子。
20.权利要求19所述的核酸，其中肌肉特异性启动子是心肌肌钙蛋白t(ctnt)启动子。
21.权利要求12至20中任一项所述的核酸，其中所述编码第一启动子的序列包含编码u6启动子、h1启动子或7sk启动子的序列。
22.权利要求12至21中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含dna序列。
23.权利要求12至22中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含rna序列。
24.权利要求12至23中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含聚腺苷(polya)序列。
25.权利要求24所述的核酸，其中所述polya序列是微型polya序列。
26.细胞，其包含权利要求12至25中任一项所述的核酸。
27.组合物，其包含权利要求12至25中任一项所述的核酸。
28.细胞，其包含权利要求27所述的组合物。
29.组合物，其包含权利要求28所述的细胞。
30.载体，其包含权利要求12至25中任一项所述的核酸。
31.权利要求30所述的载体，其中所述载体还包含编码转座元件的反向末端重复(itr)的序列。
32.权利要求31所述的载体，其中所述转座元件是转座子。
33.权利要求32所述的载体，其中所述转座子是tn7转座子。
34.权利要求33所述的载体，其中所述载体还包含编码t7转座子的5’itr的序列和编码t7转座子的3’itr的序列。
35.权利要求30至34中任一项所述的载体，其中所述载体是非病毒载体。
36.权利要求35所述的载体，其中所述非病毒载体是质粒。
37.权利要求30至34中任一项所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
38.权利要求37所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(aav)载体或腺病毒载体。
39.权利要求38所述的载体，其中所述aav载体是复制缺陷型或条件性复制缺陷型的。
40.权利要求38或39所述的载体，其中所述aav载体是重组aav载体。
41.权利要求38至40中任一项所述的载体，其中所述aav载体包含分离自或来源于以下血清型的aav载体的序列：血清型1(aav1)、2(aav2)、3(aav3)、4(aav4)、5(aav5)、6(aav6)、7(aav7)、8(aav8)、9(aav9)、10(aav10)、11(aav11)，或其任意组合。
42.权利要求38至41中任一项所述的载体，其中所述aav载体包含分离自或来源于血清型9的aav载体(aav9)的序列。
43.权利要求38至42中任一项所述的载体，其中所述aav载体包含分离自或来源于血清型2的aav载体(aav2)的序列。
44.权利要求38至43中任一项所述的载体，其中所述aav载体包含分离自或来源于aav2的序列和分离自或来源于aav9的序列。
45.权利要求30至44中任一项所述的载体，其中所述载体针对在哺乳动物细胞中的表达进行了优化。
46.权利要求30至45中任一项所述的载体，其中所述载体针对在人细胞中的表达进行了优化。
47.组合物，其包含权利要求30至46中任一项所述的载体。
48.权利要求47所述的组合物，其还包含可药用载体。
49.细胞，其包含45或46所述的组合物。
50.权利要求49所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
51.权利要求49或50所述的细胞，其中所述细胞是心肌细胞。
52.权利要求49或50所述的细胞，其中所述细胞是诱导多能干(ips)细胞。
53.组合物，其包含权利要求49至52中任一项所述的细胞。
54.用于校正人rbm20中的突变的方法，所述方法包括使细胞与权利要求47或48中任一项所述的组合物在适于表达所述第一grna和所述腺嘌呤碱基编辑器的条件下接触，其中所述第一grna与所述腺嘌呤碱基编辑器形成复合物，其中所述复合物修饰突变，从而对rbm20的编码序列进行恢复性校正。
55.细胞，其通过权利要求54所述的方法产生。
56.在有此需要的对象中治疗扩张型心肌病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的权利要求47或48中任一项所述的组合物。
57.权利要求56所述的方法，其中所述组合物经局部施用。
58.权利要求56或57所述的方法，其中将所述组合物直接施用于心脏组织。
59.权利要求56至58中任一项所述的方法，其中所述组合物通过输注或注射施用。
60.权利要求56所述的方法，其中所述组合物经全身施用。
61.权利要求60所述的方法，其中所述组合物通过静脉内输注或注射施用。
62.权利要求56至61中任一项所述的方法，其中在施用所述组合物之后，所述对象表现出正常的肌节结构架构、rbm20的核定位、不存在rnp颗粒形成，或其组合。
63.权利要求56至62中任一项所述的方法，其中在施用所述组合物之后，所述对象表现出改善的lv功能。
64.权利要求56至63中任一项所述的方法，其中所述对象是新生儿、婴儿、儿童、年轻成人或成人。
65.权利要求56至64中任一项所述的方法，其中所述对象是男性。
66.权利要求56至64中任一项所述的方法，其中所述对象是女性。
67.治疗有效量的权利要求47或48中任一项所述的组合物用于在有此需要的对象中治疗扩张型心肌病的用途。
68.指导rna(grna)，其包含5’-gatatggcccagaaaggccg-3’(seq id no:5)的靶向核酸序列。
69.权利要求68所述的grna，其中所述grna是先导编辑(pe)grna(pegrna)。
70.权利要求68或69所述的grna，其中所述grna用于修饰人rbm20基因以校正c1906a突变。
71.权利要求68所述的grna，其中所述grna还包含引物结合位点，所述引物结合位点包含5’-cctttctgggc-3’(seq id no:6)的核酸序列。
72.权利要求71所述的grna，其中所述grna还包含逆转录酶模板，所述逆转录酶模板包含5’-ggactacgagagcgcgg-3’(seq id no:7)的核酸序列。
73.组合物，其包含先导编辑器和靶向人rbm20中的突变的grna。
74.权利要求73所述的组合物，其中所述先...
【专利技术属性】
技术研发人员：埃里克·N·奥尔松，罗达·巴塞尔达比，西山孝彦，
申请(专利权)人：德克萨斯大学系统董事会，
类型：发明
国别省市：
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