【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开涉及一种新型启动子和使用该启动子产生靶物质的方法，更具体地，涉及一种具有启动子活性的新型多核苷酸、包含该启动子的载体和棒状杆菌属(corynebacterium)的微生物、使用该微生物产生靶物质的方法以及该启动子的用途。
技术介绍
1、在微生物中产生靶物质(例如，氨基酸)的各种研究已经涉及生态友好和安全的产生方法，其中在棒状杆菌属的微生物中大量产生靶物质的研究已经连续进行。棒状杆菌属(棒状杆菌属物种)的微生物，尤其谷氨酸棒状杆菌是革兰氏阳性微生物，其通常用于产生l-氨基酸和其它有用物质。为了产生l-氨基酸和其它有用物质，已经进行了各种研究以开发能够实现高效产生和发酵工艺技术的微生物。
2、l-赖氨酸是一种由棒状杆菌属的微生物产生的代表性物质，用于动物饲料和人类药物和化妆品工业，并通过使用棒状杆菌属菌株发酵而产生。具有增强的l-赖氨酸生物合成相关基因的微生物和使用其产生l-赖氨酸产生的方法是已知的(kr 10-0924065b1)。
3、l-苏氨酸是一种必需氨基酸，广泛用作饲料和食品添加剂，也用于医药目的，用作浸剂和药物的合成原料。由于植物蛋白中的l-苏氨酸较少，素食饮食的动物容易缺乏l-苏氨酸，因此l-苏氨酸特别有效地用作动物饲料的添加剂。l-苏氨酸主要通过使用经人工突变或基因重组开发的大肠杆菌或棒状杆菌属微生物发酵而产生。通常，使用重组菌株的方法是已知的，该方法通过将大肠杆菌来源的苏氨酸操纵子导入产苏氨酸的黄色短杆菌(brevibacterium flavum)菌株中以产生l-苏氨酸(turbae
4、o-乙酰基高丝氨酸是用作产生甲硫氨酸的前体的物质，并且是甲硫氨酸生物合成途径的中间体(wo2008/013432)。o-乙酰基-l-高丝氨酸是由高丝氨酸o-乙酰基转移酶以l-高丝氨酸和乙酰-coa为底物合成的。
5、异亮氨酸是一种不在体内合成的必需氨基酸，已知具有促进生长、增强神经功能、增强肝功能和增强肌肉的作用，并且通常通过使用微生物发酵来产生。
6、由于需要在多种微生物，即埃希氏菌属(escherichia)微生物、棒状杆菌属微生物或芽孢杆菌属微生物中显示高表达效率的系统，因此仍然需要开发通用启动子。还期望通用启动子在开发时不局限于特定靶物质，可以用于产生多种物质。
7、技术问题
8、在本公开中鉴定到，与已知启动子相比，新型合成启动子当以正向存在时，对下游基因具有高表达活性，导致各种靶物质的产生。
9、技术方案
10、本公开的一个方面是提供具有启动子活性的多核苷酸。
11、本公开的另一个方面是提供一种载体或表达盒，其包括：多核苷酸；和编码靶蛋白并与所述多核苷酸可操作地连接的基因。
12、本公开的另一个方面是提供棒状杆菌属的微生物，其包括：多核苷酸；或多核苷酸和编码靶蛋白并与所述多核苷酸可操作地连接的基因。
13、本公开的又一方面是提供一种用于产生靶物质的方法，该方法包括：在培养基中培养棒状杆菌属的微生物；以及回收培养基中的靶物质。
14、本公开的另一个方面是提供多核苷酸作为启动子的用途，所述多核苷酸具有启动子活性，其中在seq id no：1的多核苷酸序列中，位置27、28、31、32和36处的核苷酸被其它核苷酸取代。
15、有益效果
16、本公开的具有启动子活性的新型多核苷酸可以导入产生靶物质的微生物中，从而增加靶物质的产量。由于提高了产率，所以在工业方面可以预期生产的便利性、制造成本的降低和其它效果。
技术实现思路
1、以下将具体描述本公开。本公开中公开的每个描述和实施方案也可以应用于其他描述和实施例。也就是说，本公开中公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受以下具体描述的限制
2、此外，本领域技术人员将认识到或能够仅通过使用常规实验来确定本文所述的本公开的具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在被本公开所涵盖。
3、本公开的一个方面是提供具有启动子活性的多核苷酸。
4、具体地，本公开的具有启动子活性的多核苷酸可以是具有启动子活性并且在seqid no：1的多核苷酸序列中包括至少一个多核苷酸取代的多核苷酸。
5、如本文所用，术语“多核苷酸”是指由核苷酸单体共价连接成长链的核苷酸聚合物，并且所述多核苷酸是具有预定长度或更长的dna链。
6、如本文所用，“具有启动子活性的多核苷酸”是指存在于待表达基因(即靶基因)转录的位点附近的dna区域，包括rna聚合酶或增强子等与之结合以表达靶基因的位点。
7、本公开的具有启动子活性的多核苷酸可以用作通用增强启动子。例如，多核苷酸可以用作能够增强具有谷氨酸脱氢酶(gdh)活性的多肽的表达的启动子。或者，多核苷酸可以是涉及增加靶物质的产量或产率的多核苷酸，特别是赖氨酸、苏氨酸、o-乙酰基高丝氨酸或异亮氨酸。
8、本公开的多核苷酸可以包括具有启动子活性的任何多核苷酸，而没有限制。具体地，本公开的具有启动子活性的多核苷酸可以是具有启动子活性并且在seq id no：1的多核苷酸序列中包括至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个核苷酸取代的多核苷酸。
9、seq id no：1的多核苷酸序列的实例可以是具有谷氨酸脱氢酶启动子活性的多核苷酸。具有seq id no：1的多核苷酸序列中特定核苷酸取代的多核苷酸，只要具有启动子活性，也可以是具有谷氨酸脱氢酶启动子活性的多核苷酸。seq id no：1的多核苷酸序列可以是用于指示突变位置的代表性多核苷酸序列，并且与其对应的具有启动子活性的其它多核苷酸序列也包括在可以导入突变的序列中。例如，可作为具有谷氨酸脱氢酶(gdh)活性或其相应活性的多肽的启动子的任何多核苷酸序列可包括在可向其导入本公开的突变的序列的范围内，而没有限制。
10、seq id no：1的核苷酸序列可以在已知数据库ncbi genbank中得到证实，并且作为能够用作谷氨酸脱氢酶启动子序列的对应于seq id no：1的序列可以来源于棒状杆菌属，特别是谷氨酸棒状杆菌。然而，具有与多核苷酸的活性等同或更高的活性的序列可以包括在本公开的启动子中，而没有限制。
11、本公开提供的具有启动子活性的多核苷酸可以是通过在具有启动子活性的现有多核苷酸序列中的特定位置处的核苷酸的取代而增强其启动子活性的多核苷酸。
12、在一个实施方案中，本公开的具有启动子活性的多核苷酸可包括具有启动子活性的多核苷酸，其中在seq id no：1的核苷酸序列中至少一个核苷酸被另一个核苷酸取代。
13、在一个实施方案中，经修饰的启动子可以是具有启动子活性并包括至少一个选自seq id no：1中位置27、28、31、32和36处核苷酸的核苷酸被另一个本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有启动子活性的多核苷酸，其中在SEQ ID NO：1的多核苷酸序列中，位置27、28、31、32和36处的核苷酸被其它核苷酸取代。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中位置66和261处的核苷酸进一步被其它核苷酸取代。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中位置66处的核苷酸进一步被另一个核苷酸取代。
4.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中在SEQ ID NO：1的多核苷酸序列中，位置27处的核苷酸腺嘌呤(A)被胸腺嘧啶(T)取代；位置28处的核苷酸胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)取代；位置31处的核苷酸胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)取代；位置32处的核苷酸胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代；并且位置36处的核苷酸腺嘌呤(A)被胞嘧啶(C)取代。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中多核苷酸如SEQ ID NO：2所示。
6.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中在SEQ ID NO：1的多核苷酸序列中，位置27处的核苷酸腺嘌呤(A)被胸腺嘧啶(T)取代；位置28处的核苷酸胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)取代；位置31处的核苷酸
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中多核苷酸如SEQ ID NO：3所示。
8.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中在SEQ ID NO：1的多核苷酸序列中，位置27处的核苷酸腺嘌呤(A)被胸腺嘧啶(T)取代；位置28处的核苷酸胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)取代；位置31处的核苷酸胞嘧啶(C)被鸟嘌呤(G)取代；位置32处的核苷酸胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代；位置36处的核苷酸腺嘌呤(A)被胞嘧啶(C)取代；并且位置66处的核苷酸胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其中多核苷酸如SEQ ID NO：4所示。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸，其中多核苷酸与编码靶蛋白的基因可操作地连接。
11.一种表达盒，其包含：
12.根据权利要求10所述的表达盒，其中所述靶蛋白是谷氨酸脱氢酶(gdh)。
13.一种棒状杆菌属的微生物，其包含：
14.根据权利要求13所述的微生物，其中所述靶蛋白是谷氨酸脱氢酶(gdh)。
15.根据权利要求13所述的微生物，其中所述棒状杆菌属的微生物是谷氨酸棒状杆菌。
16.一种用于产生靶物质的方法，所述方法包括：
17.根据权利要求16所述的方法，其中靶物质是赖氨酸、苏氨酸、O-乙酰基高丝氨酸或异亮氨酸。
18.一种多核苷酸作为启动子的用途，所述多核苷酸具有启动子活性，其中SEQ ID NO：1的多核苷酸序列中位置27、28、31、32和36处的核苷酸被其他核苷酸取代。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种具有启动子活性的多核苷酸，其中在seq id no：1的多核苷酸序列中，位置27、28、31、32和36处的核苷酸被其它核苷酸取代。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中位置66和261处的核苷酸进一步被其它核苷酸取代。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中位置66处的核苷酸进一步被另一个核苷酸取代。
4.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中在seq id no：1的多核苷酸序列中，位置27处的核苷酸腺嘌呤(a)被胸腺嘧啶(t)取代；位置28处的核苷酸胞嘧啶(c)被鸟嘌呤(g)取代；位置31处的核苷酸胞嘧啶(c)被鸟嘌呤(g)取代；位置32处的核苷酸胞嘧啶(c)被胸腺嘧啶(t)取代；并且位置36处的核苷酸腺嘌呤(a)被胞嘧啶(c)取代。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中多核苷酸如seq id no：2所示。
6.根据权利要求2所述的多核苷酸，其中在seq id no：1的多核苷酸序列中，位置27处的核苷酸腺嘌呤(a)被胸腺嘧啶(t)取代；位置28处的核苷酸胞嘧啶(c)被鸟嘌呤(g)取代；位置31处的核苷酸胞嘧啶(c)被鸟嘌呤(g)取代；位置32处的核苷酸胞嘧啶(c)被胸腺嘧啶(t)取代；位置36处的核苷酸腺嘌呤(a)被胞嘧啶(c)取代；位置66处的核苷酸胞嘧啶(c)被胸腺嘧啶(t)取代；并且位置261处的核苷酸腺嘌呤(a)被鸟嘌呤(g)取代。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中多核苷酸如seq id no：3...
【专利技术属性】
技术研发人员：朴暠夽，朴素静，李翰衡，崔祐诚，金希庭，李在旼，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：
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