本发明专利技术公开了转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用。本发明专利技术公开的转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或所述转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有第65位、第94位、第132位、第300位以及第327位氨基酸突变中的一种或多种，所述突变为氨基酸残基的增加、缺失或取代。本发明专利技术还公开了编码所述转氨酶的核酸分子、包含所述核酸分子的核酸构建体、重组载体和宿主细胞。本发明专利技术还公开了一种酶制剂，所述酶制剂含有本发明专利技术所述转氨酶。本发明专利技术还公开了使用所述转氨酶制备手性胺的方法。本发明专利技术提供的酶具有底物特异性、对映体选择性和转化率高等优点。本发明专利技术提供的光学纯手性胺的制备方法具有高的反应效率、立体选择性以及收率。立体选择性以及收率。
【技术实现步骤摘要】
转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用
[0001]本专利技术属于生化领域，涉及转氨酶及其应用，尤其是在生物催化制备光学纯手性胺的应用。
技术介绍
[0002]光学纯手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体。目前，超过70％的药物及其衍生物的合成都是以手性胺作为中间体。下式II所示的(R)
‑1‑
(3
‑
氟苯基)乙胺即为一种非常重要的手性胺，应用于很多医药中间体的合成。
[0003][0004]目前，制备(R)
‑1‑
(3
‑
氟苯基)乙胺的方法主要有化学法和生物催化法。化学法的常规流程如下所示，通常以消旋的1
‑
(3
‑
氟苯基)乙胺为原料，使用3
‑
甲基
‑
2,4
‑
乙酰基丙酮诱导出手性，然后进行化学拆分提高手性，但总收率小于50％，手性S＝31，从经济和环保角度出发不适合工业化大规模生产(J.Am.Chem.Soc.2017,139，1357
‑
1359)。
[0005][0006]生物酶催化法通常利用转氨酶，通过动力学拆分消旋胺，或者通过酮的不对称合成生成手性胺。与传统的化学合成方法相比，酶法具有反应效率高、立体选择性好、反应条件温和、低能耗、环境友好等优点。
技术实现思路
[0007]本专利技术要解决的技术问题是现有技术中的酶底物特异性低、对映体选择性差和转化率低，不满足工业化生产的需求，从而提供一种能以高的反应效率、立体选择性以及收率来制备光学纯手性胺的试剂和方法。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术第一方面提供一种转氨酶，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或所述转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有第65位、第94位、第132位、第300位以及第327位氨基酸突变中的一种或多种，所述突变为氨基酸残基的增加、缺失或取代，其余位置上的氨基酸残基与SEQ ID NO:1相同。
[0009]在一个或多个实施方案中，所述突变选自下述组：第65位、第94位、第132位、第300
位的取代突变和第327位的缺失突变。优选所述突变选自以下组：V65A、L94C、S132H和D300A。
[0010]在本专利技术的优选实施方案中，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011]为解决上述技术问题，本专利技术第二方面提供一种核酸分子，其多核苷酸序列选自：
[0012](1)编码本专利技术任一实施方案所述的转氨酶的多核苷酸序列；和
[0013](2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
[0014]在本专利技术的优选实施方案中，所述多核苷酸序列选自如SEQ ID NO:3或如SEQ ID NO:4所示的多核苷酸序列或其互补序列。
[0015]为解决上述技术问题，本专利技术第三方面提供一种核酸构建体，其含有本专利技术任一实施方案所述的核酸分子；优选地，所述核酸构建体为表达盒。
[0016]为解决上述技术问题，本专利技术第四方面提供一种重组载体，其含有本专利技术任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建体；优选地，所述重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。
[0017]为解决上述技术问题，本专利技术第五方面提供一种宿主细胞，其含有本专利技术任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建体或重组载体，和/或，其表达本专利技术任一实施方案所述的转氨酶；所述宿主细胞为本领域常规，优选地，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
[0018]为解决上述技术问题，本专利技术第六方面提供一种酶制剂，所述酶制剂含有本专利技术任一实施方案所述的转氨酶。
[0019]为解决上述技术问题，本专利技术第七方面提供下式I所示的手性胺的制备方法：
[0020][0021]其中，所述方法包括，在助溶剂和任选的辅酶的存在下，使用来自节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶或与其氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的转氨酶或本文任一实施方案所述的转氨酶突变体或其酶制剂催化氨基供体与下式III所示的底物反应，从而制备得到式I所示的手性胺：
[0022][0023]其中，式I和III中，R1为卤代苯基，R2为C1‑4烷基。
[0024]优选地，式I化合物为(R)
‑1‑
(3
‑
氟苯基)乙胺，式III化合物为3
‑
氟苯乙酮。
[0025]在一个或多个实施方案中，所述节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的转氨酶为NCBI登陆号为3WWH_A、3WWI_A、5FR9_A或3WWJ_A的转氨酶。
[0026]在一个或多个实施方案中，所述助溶剂可为本领域常规，所述助溶剂选自：二甲亚砜、醇类溶剂和甲苯。
[0027]在一个或多个实施方案中，所述氨基供体可为本领域常规，所述氨基供体选自：芳香胺、脂肪胺和氨基酸。
[0028]在本专利技术的优选实施方案中，所述醇类溶剂为异丙醇。
[0029]在本专利技术的优选实施方案中，所述芳香胺为R
‑
苯乙胺。
[0030]在一个或多个实施方案中，所述脂肪胺为碳链长度为2
‑
6个碳原子的脂肪胺，优选为异丙胺或仲丁胺。
[0031]在一个或多个实施方案中，所述氨基酸为丙氨酸和/或天冬氨酸。
[0032]在一个或多个实施方案中，转氨酶的用量为反应体系中底物重量的1
‑
50％，如10
‑
40％或15
‑
30％；优选15
‑
20％。
[0033]在一个或多个实施方案中，反应体系中含有辅酶，辅酶的用量为底物重量的0.1
‑
5.0％，如1
‑
3％；优选2
‑
2.5％；优选的辅酶为5
‑
磷酸吡哆醛(PLP)。
[0034]在一个或多个实施方案中，反应体系中，氨基供体的用量为底物重量的600％
‑
1240％。
[0035]在一个或多个实施方案中，反应体系的pH6～10，优选为8～10，更优选为8.9～9.1。
[0036]在一个或多个实施方案中，反应温度为10℃～50℃，优选为20℃～45℃，更优选为28℃～35℃。
[0037]在一个或多个实施方案中，反应时间为0.1～120小时，例如0.5～48小时、10～24小时或16～92小时。
[0038]在一个或多个实施方案中，所述方法中，助溶剂为二甲亚砜或异丙醇；氨基供体为脂肪胺，优选为异丙胺或仲丁胺，或芳香胺优选R
‑
苯乙胺；转氨酶为节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶，优选为本文任一实施方案所述的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或所述转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有第65位、第94位、第132位、第300位以及第327位氨基酸突变中的一种或多种，所述突变为氨基酸残基的增加、缺失或取代。2.如权利要求1所述的转氨酶，其特征在于，所述突变选自下述组：第65位、第94位、第132位、第300位的取代突变和第327位的缺失突变；优选所述突变选自以下组：V65A、L94C、S132H和D300A。3.如权利要求2所述的转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.一种核酸分子，其多核苷酸序列选自：(1)编码权利要求1
‑
3中任一项所述的转氨酶的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；优选地，(1)所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO:3或如SEQ ID NO:4所示。5.一种核酸构建体，其含有权利要求4所述的核酸分子；优选地，所述核酸构建体为表达盒。6.一种重组载体，其含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的核酸构建体；优选地，所述重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。7.一种宿主细胞，其含有权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的核酸构建体或权利要求6所述的重组载体，和/或，其表达权利要求1
‑
3中任一项所述的转氨酶。8.一种酶制剂，所述酶制剂含有权利要求1
‑
3中任一项所述的转氨酶。9.下式I所示的手性胺的制备方法：其中，所述方法包括，在助溶剂和任选的辅酶的存在下，使用来自节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶或与其氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的转氨酶或权利要求1
‑
3中任一项所述的转氨酶或权利要求8所述的酶制剂催化氨基供体与下式III所示的底物反应，从而制备得到式I所示的手性胺：其中，式I和III中，R1为卤代苯基，R2为C1‑4烷基；优选地，式I化合物为(R)
‑1‑
(3
‑
氟苯基)乙胺，式III化合物为3
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氟苯乙酮。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少9...
【专利技术属性】
技术研发人员：周丹，李杰，郑晨抗，叶家捷，孙丰来，朱景仰，
申请(专利权)人：上海合全药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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