一种蔗糖磷酸化酶的应用及利用其制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法技术

本发明专利技术提供了一种蔗糖磷酸化酶的应用及利用其制备2

【技术实现步骤摘要】
一种蔗糖磷酸化酶的应用及利用其制备2
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α
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甘油葡萄糖苷的方法


[0001]本专利技术属于生物催化剂
，特别涉及一种新型蔗糖磷酸化酶生物的应用及利用其催化制备2
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α
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甘油葡萄糖苷的方法。

技术介绍

[0002]蔗糖磷酸化酶转化法是将蔗糖磷酸化酶基因在大肠杆菌中克隆表达，以蔗糖和甘油为底物，建立的一种酶促合成2
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α
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甘油葡萄糖苷的方法。目前，利用这种方法生产2
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α
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甘油葡萄糖苷的最高产量仅为122 g/L，并且都存在转化时间长、酶活低、稳定性差、缓冲液成本高等问题。不仅如此，副产物的产生一直是制约酶催化效率提高的重要因素。在利用蔗糖磷酸化酶催化合成2
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α
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甘油葡萄糖苷的过程中会产生果糖副产物。果糖的不断积累会严重影响蔗糖磷酸化酶的催化效率以及2
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α
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甘油葡萄糖苷的产量。因此蔗糖磷酸化酶的果糖耐受性问题也是制约其应用的一个因素。
[0003]针对现有技术中的蔗糖磷酸化酶稳定性差、不能重复利用的缺陷，已有公开的技术方案采用固定化手段来改善。目前，现有的蔗糖磷酸化酶大都通过交联酶聚集体进行固定化，此固定化方法侧重于蔗糖磷酸化酶热稳定性和重复使用次数的提高，其他方面的改善并不明显。
[0004]因此，寻找一种酶活高的新型蔗糖磷酸化酶，并提高其稳定性、重复使用次数、果糖耐受性，在水溶液中催化合成2
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α
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甘油葡萄糖苷，具有极高的工业利用价值。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是提供一种在水溶液中催化合成2
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α
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甘油葡萄糖苷的新型蔗糖磷酸化酶及其催化制备2
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α
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甘油葡萄糖苷的具体方法，该酶酶活高、催化效率快，同时果糖耐受性强、稳定性好、可多次回收再利用，提高产量、降低生产成本。
[0006]本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种蔗糖磷酸化酶的应用，基因编码如序列1所述的蔗糖磷酸化酶在水或水溶液中催化蔗糖、甘油制备生成2
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α
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甘油葡萄糖苷。本专利技术通过与现存蔗糖磷酸化酶进行同源度比对，筛选出一种来自于长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶（SPase），通过基因工程手段将所述基因导入大肠杆菌表达得到蔗糖磷酸化酶。
[0007]所述基因工程手段为：首先利用PCR对基因进行扩增，而后采用酶切连接手段将其导入表达载体质粒PET28a，通过大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达。
[0008]本专利技术用于在水或水溶液中催化蔗糖、甘油制备生成2
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α
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甘油葡萄糖苷的酶可以是游离酶也可以是固定化酶，具体制备方法如下。
[0009]一种生物催化制备2
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α
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甘油葡萄糖苷的方法，所述方法包含以下步骤：1）通过基因工程手段将序列1导入大肠杆菌表达得到蔗糖磷酸化酶，将表达蔗糖磷酸化酶的大肠杆
菌细胞用高压匀浆法破碎，得到含有蔗糖磷酸化酶的粗酶液；2）利用步骤1）得到的粗酶液在水中催化蔗糖、甘油生成2
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α
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甘油葡萄糖苷。
[0010]进一步的，步骤1）中所述粗酶液中蔗糖磷酸化酶的浓度为1mg/mL~6 mg/mL。
[0011]进一步的，步骤2）的具体操作为：称量蔗糖、甘油溶解于去离子水中，形成混合溶液，加入粗酶液，使去离子水中蔗糖磷酸化酶的浓度为0.5~1.5mg/mL；摇床催化反应后，加热灭活酶；催化反应的温度为30℃~ 50℃，时间为24h~ 48h，pH值为6~8；蔗糖在去离子水中的浓度为0.3~1.5M、 甘油在去离子水中的浓度1.8~2.4M。
[0012]另一种生物催化制备2
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α
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甘油葡萄糖苷的方法，所述方法包含以下步骤：Ⅰ、通过基因工程手段将序列1导入大肠杆菌表达得到游离酶，用CS
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TPP@NF载体固定所述游离酶，得到固定化酶，记作CS
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TPP@NF@SPase；
ꢀⅡ
、利用步骤Ⅰ得到的固定化酶在水溶液中催化蔗糖、甘油生成2
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α
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甘油葡萄糖苷。CS为壳聚糖，TPP为三聚磷酸钠, NF为TPP和氯化钙的络合物。
[0013] 进一步的，步骤Ⅰ中，将壳聚糖和三聚磷酸钠在水溶液中常温下反应5~20min后，加入游离酶和氯化钙反应5~20min，离心收集沉淀即为固定化酶CS
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TPP@NF@SPase；反应液中壳聚糖的浓度为 1mg/mL
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5mg/mL，三聚磷酸钠的浓度为100mg/mL
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150mg/mL，氯化钙的浓度为10mg/mL
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50mg/mL；固定化温度为20℃~30℃，固定时间10min~30min，固定环境为金属浴振荡800rpm~1000rpm；所述常温为20℃~30℃。
[0014]进一步的，步骤Ⅱ的具体操作为：称量蔗糖、甘油溶解于去离子水中，固定化酶CS
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TPP@NF@SPase，摇床催化反应后，加热灭活酶结束反应；蔗糖在去离子水中的浓度为0.3~1.5M、 甘油在去离子水中的浓度1.8~2.4M；步骤Ⅱ催化反应的温度为30℃~40℃，时间为24h~48h，pH值为6~9；反应液中固定化酶CS
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TPP@NF@SPase的浓度为0.5~1.5mg/mL。
[0015]本专利技术相比现有技术的有益效果为：1.本专利技术中所应用的蔗糖磷酸化酶，克服了现有技术生产2
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甘油葡萄糖苷时，存在的酶活低、反应时间长、缓冲液成本高的问题。本专利技术中所应用的蔗糖磷酸化酶催化效率高，能在水溶液中24 h内将底物蔗糖近乎完全转化，产量可达288.28 g/L。是迄今为止体外单酶生物催化制备2
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α
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甘油葡萄糖苷的最高产量。
[0016]2.现有多数固定化酶的制备耗时较长，实用性差，本专利技术采用CS
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TPP@NF，可以在20min内迅速固定游离蔗糖磷酸化酶，可以通过离心回收再利用，降低了生产成本，工艺简单，经济节约，非常适合于大规模工业化生产。
[0017]3.本专利技术的所采用的蔗糖磷酸化酶固定化酶CS
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TPP@NF@SPase，不仅稳定性好、催化效率高，并且固定化酶的果糖耐受性比游离酶高30%，有利于解决2
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α
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甘油葡萄糖苷生产中存在的副产物抑制问题。反应条件温和、高效、绿色、安全，具有光明的工业化前景。
附图说明
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蔗糖磷酸化酶的应用，其特征在于：基因编码如序列1所述的蔗糖磷酸化酶在水或水溶液中催化蔗糖、甘油制备生成2
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α
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甘油葡萄糖苷。2.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶的应用，其特征在于：所述蔗糖磷酸化酶为游离酶或固定化酶；所述固定化酶的制备方法为：通过基因工程手段将所述序列1导入大肠杆菌表达得到游离酶，用CS
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TPP@NF载体固定所述游离酶，得到固定化酶，记作CS
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TPP@NF@SPase。3.一种生物催化制备2
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α
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甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：1）通过基因工程手段将序列1导入大肠杆菌表达得到蔗糖磷酸化酶，将表达蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌细胞用高压匀浆法破碎，得到含有蔗糖磷酸化酶的粗酶液；2）利用步骤1）得到的粗酶液在水中催化蔗糖、甘油生成2
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α
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甘油葡萄糖苷。4.根据权利要求3所述的生物催化制备2
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α
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甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤1）中所述粗酶液中蔗糖磷酸化酶的浓度为1mg/mL~6mg/mL。5.根据权利要求3所述的生物催化制备2
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α
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甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤2）的具体操作为：称量蔗糖、甘油溶解于去离子水中，形成混合溶液，加入粗酶液，使混合溶液中蔗糖磷酸化酶的浓度为0.5~1.5mg/mL；摇床催化反应后，加热灭活酶；催化反应的温度为30℃~ 50℃，时间为24h~ 48h，pH值为6~8；蔗糖在去离子水中的浓度为0.3~1.5M、 甘油在去离子水中的浓1.8~2.4M。6.一种生物催化制备2
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α
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甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁浩，徐海畅，齐昊乐，伍凌奇，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：