一种使用氨基转移酶突变体制备手性内酰胺类化合物的方法技术

本发明专利技术公开了一种使用氨基转移酶突变体制备手性内酰胺类化合物的方法。具体地，所述方法包括以下步骤：在氨基转移酶突变体的存在下，将式I化合物或其盐和氨基供体进行胺化反应，在反应溶剂中进行胺化反应，得到化合物II即可；所述的氨基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的突变体为在如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上具有选自一个或多个位点的氨基酸残基的差异。本发明专利技术还公开了氨基转移酶突变体，基于所述氨基转移酶突变体开发的合成β

【技术实现步骤摘要】
一种使用氨基转移酶突变体制备手性内酰胺类化合物的方法


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及一种使用氨基转移酶突变体制备手性内酰胺类化合物的方法。

技术介绍

[0002]手性内酰胺类化合物是一种重要的药物合成前体，是多种处于临床阶段的创新化学药的重要砌块。
[0003]此前的合成方法需要至少6步化学反应，包括3步贵金属(钌，铑、钯等)催化，步骤多、收率低、成本高、原子经济性差、对环境不友好，不是一条绿色可持续的合成路线；通过酶催化的方法来合成手性内酰胺，可缩短路线至3步，且原子经济性高，反应主要在水溶液中进行，安全环保，符合绿色化学原则。
[0004]迄今为止，大部分的氨基转移酶催化得到的是β
‑
(R)手性胺，能够得到β
‑
(S)手性胺的情况主要有以下三种：一是α位有取代；二是β位取代基比较大；三是α位有取代，且β位取代基比较大。
[0005]通过天然或进化酶，催化α位没有取代且β位取代基最小(为H)的底物反应，制得β
‑
(S)手性内酰胺，且具有β
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种使用氨基转移酶突变体制备手性内酰胺类化合物的方法，包括以下步骤：在氨基转移酶突变体的存在下，将式I化合物或其盐和氨基供体进行胺化反应，在反应溶剂中进行胺化反应，得到化合物II即可；其中，R1为
‑
CHO或
‑
CH(OH)SO3‑
；R2为
‑
Me，
‑
Et或
‑
i
‑
Pr；所述的氨基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的突变体为在如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：第2位、第4位、第6位、第8位、第10位、第11位、第12位、第13位、第14位、第16位、第17位、第18位、第20位、第21位、第22位、第23位、第24位、第26位、第27位、第30位、第31位、第33位、第34位、第35位、第36位、第37位、第38位、第39位、第40位、第41位、第42位、第43位、第44位、第45位、第46位、第47位、第49位、第50位、第52位、第53位、第55位、第60位、第62位、第63位、第64位、第65位、第66位、第67位、第68位、第70位、第71位、第72位、第73位、第74位、第75位、第76位、第78位、第79位、第80位、第81位、第82位、第83位、第85位、第86位、第87位、第88位、第89位、第90位、第91位、第92位、第93位、第94位、第95位、第96位、第97位、第98位、第99位、第100位、第101位、第102位、第103位、第104位、第105位、第106位、第107位、第109位、第111位、第112位、第113位、第114位、第115位、第116位、第117位、第118位、第122位、第127位、第128位、第129位、第130位、第131位、第132位、第133位、第134位、第135位、第136位、第137位、第138位、第139位、第140位、第143位、第145位、第146位、第149位、第153位、第154位、第156位、第157位、第158位、第160位、第161位、第162位、第163位、第164位、第165位、第166位、第168位、第169位、第170位、第171位、第172位、第174位、第176位、第177位、第178位、第179位、第180位、第181位、第182位、第183位、第184位、第185位、第186位、第187位、第188位、第189位、第192位、第193位、第194位、第195位、第196位、第197位、第198位、第199位、第203位、第204位、第205位、第211位、第212位、第213位、第214位、第215位、第216位、第218位、第219位、第220位、第221位、第222位、第224位、第226位、第227位、第228位、第229位、第232位第233位、第234位、第237位、第246位、第247位、第248位、第249位、第250位、第252位、第253位、第255位、第256位、第259位、第262位、第263位、第264位、第265位、第266位、第267位、第268位、第269位、第271位、第275位、第276位、第277位、第278位、第279位、第280位、第281位、第282位、第283位、第284位、第285位、第286位、第288位、第290位、第291位、第292位、第293位、第294位、第298位、第299位、第300位、第301位、第302位、第303位、第304位、第306位、第309位、第310位、第311位、第312位、第313位、第315位、第316位、第317位、第318位、第320位、第321位、第323位、第324位、第325位、第326位、第334位、第335位、第336位、第337位、第338位、第339位、第340位、第342位、第343位、第344位、第345位、第346位、第347
位、第348位、第349位、第351位、第352位、第353位、第354位、第355位、第356位、第357位、第359位、第360位、第361位、第362位、第363位、第364位、第365位、第366位、第367位、第368位、第369位、第370位、第371位、第372位、第375位、第377位、第379位、第380位、第381位、第382位、第383位、第384位、第385位、第386位、第388位、第389位、第390位、第391位、第392位、第393位、第394位、第395位、第397位、第398位、第400位、第401位、第404位、第405位、第406位、第407位、第408位、第409位、第411位、第412位、第414位、第415位、第418位、第419位、第420位、第421位、第422位、第423位、第425位、第426位、第427位、第429位、第430位、第431位、第432位、第433位、第434位、第436位、第438位、第441位、第442位、第443位、第444位、第445位、第446位、第447位、第448位、第449位、第450位、第452位、第453位、第454位、第455位、第456位、第457位、第458位、第459位、第460位、第461位、第462位、第463位、第464位、第465位、第466位、第467位、第468位、第469位、第470位和第471位中的一个或多个。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其满足下述条件的一个或多个：(1)所述的式I化合物独立地为所述的式I化合物的盐独立地为(2)所述的氨基供体为异丙胺、L
‑
丙氨酸、DL
‑
丙氨酸、L
‑
赖氨酸、DL
‑
赖氨酸、(S)
‑1‑
苯乙胺、(R)
‑1‑
苯乙胺、(RS)
‑1‑
苯乙胺、戊二胺、邻苯二甲胺、邻苯二甲胺盐酸盐、2
‑
(4
‑
硝基苯)乙胺和2
‑
(4
‑
硝基苯)乙胺盐酸盐中的一种或多种；较佳地，所述氨基供体为异丙胺；(3)所述的氨基供体与所述的式I化合物或其盐的摩尔比为(1～5):1，例如1:1、2:1或4:1；(4)所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液，或缓冲液和有机溶剂的混合物，所述的有机溶剂为甲基叔丁基醚、异丙醚、四氢呋喃、2
‑
甲基四氢呋喃、1,4
‑
二氧六环、乙酸乙酯、二甲基亚砜、N,N
‑
二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇；(5)所述的氨基酸突变体与所述的式I化合物或其盐的质量比为1:(1
‑
2)，例如1:2；(6)所述的胺化反应的pH值为6.0～10.5；优选为7.0～10.0；例如8.0、8.5、9.0、9.75或10；(7)所述的胺化反应的反应温度为27℃～55℃；例如27℃、37℃、47℃、52℃或55℃；(8)所述的胺化反应的反应时间通常与反应规模相关，优选为16～20h；例如16h；(9)所述差异为缺失、增加或替换。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其满足下述条件的一个或多个：(1)当所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液和有机溶剂的混合物时，所述的有机溶剂占反应总体积的比例为0～250mL/L；(2)所述的胺化反应的反应溶剂为缓冲液；(3)所述的缓冲液为硼酸钠缓冲液，磷酸盐缓冲液(PBS)、三羟甲基甲胺盐缓冲液(TRIS)和三乙醇胺盐缓冲液(TEOA)中的一种或多种；优选为硼酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、
三羟甲基甲胺盐缓冲液或三乙醇胺盐缓冲液；(4)所述的缓冲液与所述的式I化合物或其盐的体积质量比为10～50mL/g，例如16mL/g、25mL/g、32mL/g或50mL/g。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，其满足下述条件的一个或多个：(1)所述的手性内酰胺类化合物的制备方法，其包括以下步骤：向所述的缓冲液和氨基供体的混合液中，加入所述的式I化合物或其盐和所述的氨基转移酶突变体，混合均匀后在27℃～55℃下反应即可；(2)所述的胺化反应结束后还包括以下后处理步骤：加入碱调节pH至13，加有机溶剂萃取，并除去有机溶剂即可。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其满足下述条件的一个或多个：(1)所述的后处理步骤中，所述的有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯和叔丁基甲醚中的一种或多种，优选为二氯甲烷；(2)所述的碱为氢氧化钠或氢氧化钾，例如氢氧化钾；(3)所述的除去有机溶剂的方式为减压蒸馏，例如在压力为
‑
0.09Mpa下减压蒸馏。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基转移酶突变体在如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上具有选自以下一个或多个位点的氨基酸残基的差异：第002位氨基酸残基突变为N、K、T、D或Q，第004位氨基酸残基突变为C、W、Q、N、V、F、K、S、I、Y、T、H、L、M、P或G，第006位氨基酸残基突变为W、R、V、K、H、M或P，第008位氨基酸残基突变为R、N、V、K、S、H、L、M、Y或Q，第010位氨基酸残基突变为E、Q、N、V、S、I、Y、D或G，第011位氨基酸残基突变为R、N、K、S、L或P，第012位氨基酸残基突变为C、F、S、A、L、M、Y或D，第013位氨基酸残基突变为C、W、E、V、S、I或H，第014位氨基酸残基突变为W、V、K、T、H、L、M或P，第016位氨基酸残基突变为C、W、N、K、P、I、A、T、H、M或Y，第017位氨基酸残基突变为R、E、N、V、F、S、I、A、M或D，第018位氨基酸残基突变为R、E、S、I、T、Y或D，第020位氨基酸残基突变为C、Q、E、F、K、H、M或G，第021位氨基酸残基突变为R、E、Q、N、V、lI、F、K、P、S、I、T、H、M、Y、D或G，第022位氨基酸残基突变为C、W、R、E、N、K、I、T、L、M或G，第023位氨基酸残基突变为R、F、K、T、H、M、Y或D，第024位氨基酸残基突变为R、V、F、I或H，第026位氨基酸残基突变为E、K、I、P、C、Q、G、W、V、F、T、H、M、D、N、S、A、L或Y，第027位氨基酸残基突变为R、E、N、V、K、S、H、M或Q，第030位氨基酸残基突变为C、W、N、V、K、I、T、Y、D或G，第031位氨基酸残基突变为N、V、S、H、Y、D或Q，第033位氨基酸残基突变为N、A、L、Y或G，第034位氨基酸残基突变为C、E、Q、N、V、K、S、I、Y、A、L、P、D或G，第035位氨基酸残基突变为C、W、S、I、A、T、L、M、D或G，第036位氨基酸残基突变为N、I、A、H、Y或Q，第037位氨基酸残基突变为E、K、I、P、C、G、Q、W、R、V、F、T、H、M、D、N、S、A、L或Y，第038位氨基酸残基突变为E、V、F、K、S、I、A、L、P或G，第039位氨基酸残基突变为R、E、K、A、H或P，第040位氨基酸残基突变为C、W、E、N、S、A、T、L、M、P或Q，第041位氨基酸残基突变为W，第042位氨基酸残基突变为C、R、Q、N、V、F、T、H、M、D或G，第043位氨基酸残基突变为W、E、N、F、S或Q，第044位氨基酸残基突变为G、R、V、F、K、S、A、M、Y或Q，第045位氨基酸残基突变为R、E、L、P、D或G，第046位氨基酸残基突变为E、K、P、T、H或Y，第047位氨基酸残基突变为C、W、V、F、I、A、L、D或G，第049位氨基酸残基突变为C、W、R、N、K、T或M，第050位氨基酸残基突变为C、W、R、K、S、I、A、T、L或Q，第052位氨基酸残基突变为R、T、H、L、M或Q，第053位氨基酸残基突变为C、E、F、P、S、A、T、M、Y或G，第055位氨基酸残基突变为G、R、F、K、P、L、M、Y或Q，第060位氨基酸残基突变为C、
R、N、V、K、S、Y、T、H、M、P或Q，第062位氨基酸残基突变为W、N、H、L、M或G，第063位氨基酸残基突变为W、V、K、P、S、T、L、Y或Q，第064位氨基酸残基突变为C、R、Q、E、V、H、L、M或G，第065位氨基酸残基突变为C、R、N、V、T、H、L、M或P，第066位氨基酸残基突变为R、N、V、F、S、I、A、T、L、M、P或Q，第067位氨基酸残基突变为R、N、V、K、I、P或G，第068位氨基酸残基突变为W、R、Q、E、V、F、K、S、I、A、T、H、L、M、P、D或G，第070位氨基酸残基突变为R、Q、E、F、H或G，第071位氨基酸残基突变为C、Q、E、T、M或G，第072位氨基酸残基突变为C、N、V、K、S、M、P或G，第073位氨基酸残基突变为C、W、R、E、N、V、F、K、P、S、I、A、T、H、M、Y、D或Q，第074位氨基酸残基突变为C、N、S、I、A、H、L、M、D或G，第075位氨基酸残基突变为A、C、R或K，第076位氨基酸残基突变为C、R、Q、N、F、P、L、Y或G，第078位氨基酸残基突变为C、K或T，第079位氨基酸残基突变为R、K、S、A或M，第080位氨基酸残基突变为C、R、V、S、A、H、L、P或Q，第081位氨基酸残基突变为C、N、V、F、I、L、P、D或G，第082位氨基酸残基突变为R、N、F、K、I、T、M、Y或G，第083位氨基酸残基突变为G、S、I、H、L、M、Y或Q，第085位氨基酸残基突变为C、N、F、K、T、H或Y，第086位氨基酸残基突变为C、W、R、E、V、F、K、P、S、I、A、T、H、L、M、Y、D或G，第087位氨基酸残基突变为W、E、I、Y、T、H、P、D或Q，第088位氨基酸残基突变为N、V、F、S、T、H、Y或G，第089位氨基酸残基突变为C、N、I、T、D或G，第090位氨基酸残基突变为G、W、N、V、K、S、A、T、H、L、M或Q，第091位氨基酸残基突变为W、N、I、T、M或P，第092位氨基酸残基突变为L、T、A或N，第093位氨基酸残基突变为C、V、F、A、L、P或Q，第094位氨基酸残基突变为W、Q、H、M或G，第095位氨基酸残基突变为W、N、K、S或A，第096位氨基酸残基突变为V、I、A、H或G，第097位氨基酸残基突变为R、N、V、S、T、H、L、M或D，第098位氨基酸残基突变为C、W、E、Q、N、V、F、S、I、A、P、D或G，第099位氨基酸残基突变为C、F、K、L或P，第100位氨基酸残基突变为P或K，第101位氨基酸残基突变为W、E、V、K、I、T、Y、D或G，第102位氨基酸残基突变为W、P、S、I、T、H、Y或Q，第103位氨基酸残基突变为E、N、V、F、K、S、I、Y、T、L、P或Q，第104位氨基酸残基突变为C、F、K、S、Y或D，第105位氨基酸残基突变为V、K、S、A、H、M、D或Q，第106位氨基酸残基突变为G、W、R、F、T、P或Q，第107位氨基酸残基突变为E、N、V、K、S、Y或Q，第109位氨基酸残基突变为C、W、F、I、A、T或H，第111位氨基酸残基突变为R、E、N、V、F、K、A、T或H，第112位氨基酸残基突变为C、R、E、F、K、A、T、H、M、D或Q，第113位氨基酸残基突变为W、F、K、P、S、I、T、M、Y或G，第114位氨基酸残基突变为C、W、R、K、S、I、A、T、H或G，第115位氨基酸残基突变为C、W、R、S、Y、A、T、L、M、P或Q，第116位氨基酸残基突变为F、A、M、D或Q，第117位氨基酸残基突变为W、R、E、S、T、H、L或G，第118位氨基酸残基突变为Q、N、P、S、T、H、L、Y、D或G，第122位氨基酸残基突变为E、K、I、P、C、Q、G、W、R、V、F、T、H、M、D、S、A、L或Y，第127位氨基酸残基突变为G、C、M或N，第128位氨基酸残基突变为C、W、V、F、I、A、M、Y或Q，第129位氨基酸残基突变为C、R、Q、N、K、I、H或G，第130位氨基酸残基突变为C、F、K、I、Y、M、P或Q，第131位氨基酸残基突变为E、F、K、I、T、L、M、P或Q，第132位氨基酸残基突变为C、W、N、V、K、S、I、T、Y、D或G，第133位氨基酸残基突变为R、E、T、H、M、D或G，第134位氨基酸残基突变为R、E、N、F、A、H、M或G，第135位氨基酸残基突变为E、Q、K、S、I、L、Y、D或G，第136位氨基酸残基突变为R、Q、V、P、I、T、H、Y、D或G，第137位氨基酸残基突变为G、C、F、S、H、M、P或Q，第138位氨基酸残基突变为E、F、K、I、T、M或D，第139位氨基酸残基突变为G、F、K、I、T、L或Q，第140位氨基酸残基突变为W、R、E、Q、N、F、K、S、T、H、L、Y、D或G，第143位氨基酸残基突变为R、E、F、K、P、I、T、L、M或Y，第145位氨基酸残基突变为W、R、E、V、K、S、H、L、M、Y、D或G，第146位氨基酸残基突变为W、R、K、P、T、H、L、M、Y或Q，第149位氨基酸残基突变为G、R、E、V、I、T、H、L、M、P或Q，第153位氨基酸残基突变
为E、N、F、K、I、T、H、L、M或P，第1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王南，朱露，孟枭，朱景仰，刘超，代丹梅，文湘辉，
申请(专利权)人：上海合全药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：