一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法及其应用技术

一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法及其应用，属于微生物发酵技术领域。本发明专利技术方法包括：(1)将肠膜明串珠菌接种于MRS液体培养基中，静置培养，获得种子液；(2)将种子液置于产酶培养基中，静置培养，获得葡聚糖蔗糖酶。本发明专利技术还提供了通过该方法制备得到的高酶活葡聚糖蔗糖酶及其应用。本发明专利技术通过优化发酵培养基和产酶条件，发酵周期短，产酶效率高，酶活高达到5.07U/mL。所产葡聚糖蔗糖酶最适作用温度为30℃，最适pH值为5，酶活力稳定，可体外催化蔗糖合成胞外多糖。催化蔗糖合成胞外多糖。催化蔗糖合成胞外多糖。

【技术实现步骤摘要】
一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法及其应用


[0001]本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法及其应用。

技术介绍

[0002]葡聚糖蔗糖酶(Glucansucrase)(EC.2.4.5.1)可催化胞外同源多糖如葡聚糖、果糖等的合成。葡聚糖作为常见胞外多糖具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、增稠、益生等功能特性，广泛应用在医药、食品、化学等领域。葡聚糖蔗糖酶是胞外多糖合成过程中的主要调控酶蛋白，主要由明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)及乳杆菌属(Lactobacillus)等乳酸菌产生。乳酸菌被认为是安全或通常是安全的(Generally RegardAs Safe,GRAS)菌株，乳酸菌来源的葡聚糖蔗糖酶被广泛应用于食品和医药等领域，是目前微生物葡聚糖蔗糖酶的主要研究对象。挖掘自然界中丰富的细菌资源，发现高产葡聚糖蔗糖酶的细菌菌株，以短周期、低成本获得更多的葡聚糖蔗糖酶，一直是微生物学领域的研究热点。然而，乳酸菌代谢产物多样，葡聚糖蔗糖酶产量较低，限制其工业化开发及应用。在发酵过程中，培养基成分和比例在很大程度上对菌株生长及代谢产物分泌起到重要的影响作用。此外发酵条件如温度、pH值、培养转速也会对发酵代谢产生影响。为了满足工业化低成本、高效率的要求，对优良菌株进行发酵条件优化，以期利用最低的成本获得更高的经济效益。优化作为研究菌株发酵过程的重要手段，可以有效地确定菌株产酶的最适培养条件及培养基组分。目前关于葡聚糖蔗糖酶的发酵参数优化鲜有报道。因此提高乳酸菌分泌葡聚糖蔗糖酶水平并开展应用探索，对于拓展微生物葡聚糖蔗糖酶来源、促进葡聚糖蔗糖酶发酵及应用的工业化进程，具有积极意义。

技术实现思路

[0003]针对上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法及其应用。本专利技术方法操作简便，葡聚糖蔗糖酶产量高、稳定性好，为葡聚糖蔗糖酶的结构性质研究及体外合成胞外多糖提供理论基础。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0005]一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0006](1)将肠膜明串珠菌接种于MRS液体培养基中，静置培养，获得种子液；
[0007](2)将上述步骤(1)获得的种子液置于产酶培养基中，静置培养，获得葡聚糖蔗糖酶。
[0008]所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中静置培养的条件为：培养温度30
‑
35℃，培养时间16
‑
20h。
[0009]所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中肠膜明串珠菌的接种量为1
‑
3％v/v。
[0010]所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述步骤(2)
中产酶培养基的条件为pH 4
‑
8，培养温度25
‑
40℃，培养时间24
‑
48h，优选培养温度30℃，优选培养时间24h。
[0011]所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述步骤(2)中种子液的接种量为1
‑
8％v/v。
[0012]所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述种子液的接种量为4％v/v。
[0013]所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述步骤(2)中产酶培养基的原料包括：蔗糖5
‑
60g/L，胰蛋白胨2
‑
20g/L，牛肉浸粉2
‑
20g/L，酵母浸粉2
‑
20g/L，无水乙酸钠2
‑
20g/L，K2HPO
42‑
10 g/L，柠檬酸铵2
‑
10g/L，CaCl
20‑
6 mM，MgSO4·
7H2O 0.5
‑
0.6g/L，MnSO4·
4H2O 0.2
‑
0.3g/L，吐温801
‑
2mL/L。
[0014]所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述步骤(4)中产酶培养基的原料包括：蔗糖35g/L，酵母浸粉5g/L，牛肉浸粉6g/L，胰蛋白胨6g/L，无水乙酸钠5g/L，K2HPO44 g/L，柠檬酸铵2g/L，CaCl24 mM，MgSO4·
7H2O 0.58g/L，MnSO4·
4H2O0.25g/L，吐温801mL/L。
[0015]一种高酶活葡聚糖蔗糖酶，其特征在于是采用任一所述的方法发酵生产得到的。
[0016]任一所述的方法在发酵产高酶活葡聚糖蔗糖酶中的应用。
[0017]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0018]本专利技术中以肠膜明串珠菌为菌种进行发酵产葡聚糖蔗糖酶，培养基成分和产酶方法简单，条件温和，发酵周期短，酶活高，提升生产效率的同时，大大减少发酵成本，且酶活力稳定等优点，有利于后一步进行应用方面研究。
附图说明
[0019]图1为本专利技术肠膜明串珠菌产葡聚糖蔗糖酶进程图；
[0020]图2为葡聚糖蔗糖酶最适反应pH值和最适反应温度图；
[0021]图3为葡聚糖蔗糖酶体外合成胞外多糖图。
具体实施方式
[0022]以下将结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。
[0023]实施例1：葡聚糖蔗糖酶发酵优化
[0024]1)制备种子液
[0025]将肠膜明串珠菌接种于基础MRS液体培养基中(葡萄糖20g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉浸粉10g/L，酵母浸粉5g/L，K2HPO42 g/L，柠檬酸铵2g/L，无水乙酸钠5g/L，MgSO4·
7H2O0.58g/L，MnSO4·
4H2O 0.25g/L，吐温801mL/L，pH 6)中，30℃条件下静置培养，使培养基中初始细胞浓度为1.0
×
108个/mL，即为种子液。
[0026]2)单因素优化
[0027]在MRS基础培养基的基础上，将种子液接种于产酶培养基中，依次考察蔗糖浓度、胰蛋白胨浓度，牛肉浸粉浓度、酵母浸粉浓度、K2HPO4浓度、柠檬酸铵浓度、无水乙酸钠浓度、CaCl2添加量、接种量、初始pH值、发酵时间对菌株葡聚糖蔗糖酶产量的影响。
[0028]3)葡聚糖蔗糖酶活性测定
[0029]将发酵液于4℃条件下8000
×
g，离心20min，弃去菌体沉淀，上清液即为葡聚糖蔗糖酶粗酶液。利用DNS法测定葡聚糖蔗糖酶的活性。
[0030]本实施例获得的菌株产葡聚糖蔗糖酶的最佳条件为：蔗糖35g/L，酵母浸粉5g/L，牛肉浸粉6g/L，胰蛋白胨6g/L，K2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将肠膜明串珠菌接种于MRS液体培养基中，静置培养，获得种子液；(2)将上述步骤(1)获得的种子液置于产酶培养基中，静置培养，获得葡聚糖蔗糖酶。2.如权利要求1所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中静置培养的条件为：培养温度30
‑
35℃，培养时间16
‑
20h。3.如权利要求1所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述步骤(1)中肠膜明串珠菌的接种量为1
‑
3％v/v。4.如权利要求1所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述步骤(2)中产酶培养基的条件为pH 4
‑
8，培养温度25
‑
40℃，培养时间24
‑
48h，优选培养温度30℃，优选培养时间24h。5.如权利要求1所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述步骤(2)中种子液的接种量为1
‑
8％v/v。6.如权利要求5所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述种子液的接种量为4％v/v。7.如权利要求1所述的一种肠膜明串珠菌发酵产葡聚糖蔗糖酶的方法，其特征在于所述步骤(2)中产酶培养基的原料包括：蔗糖5

【专利技术属性】
技术研发人员：杜仁鹏，葛菁萍，赵丹，平文祥，于连升，张文，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：