一种在酵母基因中定点敲入外源基因的方法技术

本发明专利技术公开一种在酵母基因中定点敲入外源基因的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术所述的在酵母基因中定点敲入外源基因的方法，其步骤如下：将携带有Cas9基因和sgRNA转录基因的载体，与外源基因片段，共同转化至酵母体内，转录后的sgRNA引导Cas9蛋白至酵母靶向基因的靶点处，切割靶点，并在靶点处引入DNA双链断裂，然后利用同源重组，将外源基因敲入靶点中，从而实现外源基因在酵母基因中的定点敲入。本发明专利技术实现了以更短的同源臂序列完成同源重组，从而在酿酒酵母ADE2基因第640～641位碱基之间敲入外源基因，这在现有技术的基础上具有突出的进步。有突出的进步。有突出的进步。

【技术实现步骤摘要】
一种在酵母基因中定点敲入外源基因的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种在酵母基因中定点敲入外源基因的方法。

技术介绍

[0002]酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种典型的真核生物系统，其具有优良的鲁棒性、对苛刻发酵条件的耐受性、基因工程操作的高效性和公认的安全性，是代谢工程中最重要的宿主之一，在学术研究和工业发酵中已经得到了广泛应用。酿酒酵母中ADE2基因被破坏后，酵母的腺嘌呤(Adenine)的合成会受到抑制，当平板上的腺嘌呤被消耗完毕时，酵母试图通过自身代谢合成腺嘌呤以供应用，但是ADE2基因被破坏，合成受阻，又因为ADE4、ADE5、ADE6、ADE7、ADE8基因均正常，从而造成中间产物P
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ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累使得菌落变成粉色。因此，可以将ADE2基因作为靶向基因，进行基因编辑，包括敲除、敲入、替换和点突变等，例如，在ADE2基因的特定位点，引入外源基因片段，以实现外源基因片段功能的研究和应用，这展现了ADE2基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在酵母基因中定点敲入外源基因的方法，其特征在于，步骤如下：将携带有Cas9基因和sgRNA转录基因的载体，与外源基因片段，共同转化至酵母体内，转录后的sgRNA引导Cas9蛋白至酵母靶向基因的靶点处，切割靶点，并在靶点处引入DNA双链断裂，然后利用同源重组，将外源基因敲入靶点中，从而实现外源基因在酵母基因中的定点敲入。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA转录基因是根据酵母基因的靶点序列设计的。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源基因片段的5'端和3'端均含有同源臂序列，所述同源臂序列与酵母靶向基因互为同源臂。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述外源基因片段选自单基因片段或多基因片段。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述携带有Cas9基因和sgRNA转录基因的载体，选自pACT2
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Cas9
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ADE2载体，其制备方法如下：将pACT2
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AD载体利用HindIII限制性内切酶进行酶切处理，去除ADH1启动子与ADH1终止子之间的部分；以CPB载体为模板，使用引物Cas9 F、引物Cas9 R，通过KOD
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Plus高保真酶进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：高惠敏，赵延明，祁显涛，谢传晓，苏成付，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：