一种在酵母基因中定点敲入外源基因的方法技术

本发明专利技术公开一种在酵母基因中定点敲入外源基因的方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术所述的在酵母基因中定点敲入外源基因的方法，其步骤如下：将携带有Cas9基因和sgRNA转录基因的载体，与外源基因片段，共同转化至酵母体内，转录后的sgRNA引导Cas9蛋白至酵母靶向基因的靶点处，切割靶点，并在靶点处引入DNA双链断裂，然后利用同源重组，将外源基因敲入靶点中，从而实现外源基因在酵母基因中的定点敲入。本发明专利技术实现了以更短的同源臂序列完成同源重组，从而在酿酒酵母ADE2基因第640～641位碱基之间敲入外源基因，这在现有技术的基础上具有突出的进步。有突出的进步。有突出的进步。

【技术实现步骤摘要】
一种在酵母基因中定点敲入外源基因的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种在酵母基因中定点敲入外源基因的方法。

技术介绍

[0002]酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种典型的真核生物系统，其具有优良的鲁棒性、对苛刻发酵条件的耐受性、基因工程操作的高效性和公认的安全性，是代谢工程中最重要的宿主之一，在学术研究和工业发酵中已经得到了广泛应用。酿酒酵母中ADE2基因被破坏后，酵母的腺嘌呤(Adenine)的合成会受到抑制，当平板上的腺嘌呤被消耗完毕时，酵母试图通过自身代谢合成腺嘌呤以供应用，但是ADE2基因被破坏，合成受阻，又因为ADE4、ADE5、ADE6、ADE7、ADE8基因均正常，从而造成中间产物P
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ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累使得菌落变成粉色。因此，可以将ADE2基因作为靶向基因，进行基因编辑，包括敲除、敲入、替换和点突变等，例如，在ADE2基因的特定位点，引入外源基因片段，以实现外源基因片段功能的研究和应用，这展现了ADE2基因的重要用途。
[0003]然而，随着基因工程的进一步拓展，细胞工厂的构建与途径优化过程也暴露出了缺陷和局限，例如，需要在单一位点进行多次操作等，从而使其成为基因和代谢工程的限速步骤。CRISPR/Cas9基因编辑技术能方便地对细胞基因组进行定点突变、缺失、插入、多基因敲除以及染色体重排等，具有低成本、高效率和操作简单等特点，因而该项技术被广泛应用于生物医药、基因治疗以及作物育种等领域。
[0004]Di Carlo等首次报道了利用CRISPR/Cas系统对酿酒酵母基因进行敲除；在没有筛选标签的情况下，通过90bp同源序列实现了CAN1基因的敲除(Nucleic Acids Res,2013,41(7):4336
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4343)。i
ū
nas等开发了用于酿酒酵母基因组多基因敲除的CRISPR/Cas9系统，最多可以同时对5个不同的基因组位点进行敲除；通过共转化gRNA质粒和相应的线性同源重组片段，单个基因至5个基因的编辑效率达到50～100％，工程菌株甲羟戊酸产量比野生型菌株提高了41倍(Metab Eng,2015,28:213
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222)。Eau Claire等成功将17个编码β
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胡萝卜素合成的基因片段一次性整合到酿酒酵母基因组中，相邻DNA片段仅有50bp互补，再一次证明了CRISPR/Cas9系统与同源重组相结合的有效性(J Ind Microbiol Biotechnol,2016,43(7):1001
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1015)。Zhang等将tRNA序列与多个gRNA串联构建了gRNA
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tRNA
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array CRISPR/Cas9(GTR
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CRISPR)系统，同时敲除8个基因的效率达到87％，极大地提高了基因编辑效率(Nat Commun,2019,10:1053)。
[0005]本专利技术致力于通过同源重组，在利用较短同源臂的情况下，实现酿酒酵母ADE2基因特定位点的基因编辑，尤其是在特定位点精确引入外源基因片段，为酵母的研究提供新思路与新方法，从而使该技术和方案在今后的农业、工业中具有更广阔的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种在酵母基因中定点敲入外源基因的方法，该方法选自如下步
骤：
[0007]将携带有Cas9基因和sgRNA转录基因的载体，与外源基因片段，共同转化至酵母体内，转录后的sgRNA引导Cas9蛋白至酵母靶向基因的靶点处，切割靶点，并在靶点处引入DNA双链断裂，然后利用同源重组，将外源基因敲入靶点中，从而实现外源基因在酵母基因中的定点敲入。
[0008]在上述方法中，sgRNA转录基因是根据酵母基因的靶点序列设计的。在本专利技术中，所述靶点指的是，基因中任意想被本领域技术人员敲入外源基因的核苷酸位点，例如，酵母ADE2基因第640～641位碱基之间的核苷酸位点。
[0009]在上述方法中，外源基因片段的5'端和3'端均含有同源臂序列，所述同源臂序列与酵母靶向基因互为同源臂。同源臂序列能够介导外源基因与酵母靶向基因之间发生同源重组，从而实现外源基因的敲入。在本专利技术中，外源基因可选自任意想被本领域技术人员敲入酵母基因的基因片段，其可以是单基因片段，也可以是双基因片段、三基因片段以及四基因片段等多基因片段。
[0010]本专利技术提供了一种携带有Cas9基因和sgRNA转录基因的载体，即pACT2
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Cas9
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ADE2载体，由如下方法制备而成：
[0011]将pACT2
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AD载体利用HindIII限制性内切酶进行酶切处理，去除ADH1启动子与ADH1终止子之间的部分；以CPB载体为模板，使用引物Cas9 F、引物Cas9 R，通过KOD
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Plus高保真酶进行Cas9及核定位信号的扩增，获得Cas9基因片段；将酶切后的pACT2
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AD载体与Cas9基因片段利用连接酶进行连接，获得pACT2
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Cas9载体；将pACT2
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Cas9载体使用HpaI限制性内切酶进行酶切处理，获得线性化pACT2
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Cas9载体，将线性化载体和sgRNA转录基因片段利用NEB连接酶进行连接，获得pACT2
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Cas9
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ADE2载体。
[0012]上述pACT2
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Cas9
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ADE2载体制备方法中，引物Cas9 F的核酸序列选自SEQ ID NO:14，引物Cas9 R的核酸序列选自SEQ ID NO:15。
[0013]上述pACT2
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Cas9
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ADE2载体制备方法中，可在sgRNA转录基因片段中添加启动子，用于sgRNA的转录启动。所述启动子选自SNR52启动子。
[0014]在一个具体实施方案中：
[0015]采用酿酒酵母实施本专利技术的上述技术方案，靶向基因选自ADE2基因，靶点选自ADE2基因第640～641位碱基之间的核苷酸位点，靶点序列选自aattgtagagactatccaca，sgRNA转录基因片段可根据该靶点序列进行设计，以使转录形成的sgRNA能够识别ADE2基因中的该靶点序列，引导Cas9蛋白切割靶点，为同源重组创造有利条件。
[0016]本专利技术的有益效果为：
[0017]酿酒酵母中ADE2基因被破坏后，酵母的腺嘌呤(Adenine)的合成会受到抑制，当平板上的腺嘌呤被消耗完毕时，酵母试图通过自身代谢合成腺嘌呤以供应用，但是ADE2基因被破坏，合成受阻，又因为ADE4、ADE5、ADE6、ADE7、ADE8基因均正常，从而造成中间产物P
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在酵母基因中定点敲入外源基因的方法，其特征在于，步骤如下：将携带有Cas9基因和sgRNA转录基因的载体，与外源基因片段，共同转化至酵母体内，转录后的sgRNA引导Cas9蛋白至酵母靶向基因的靶点处，切割靶点，并在靶点处引入DNA双链断裂，然后利用同源重组，将外源基因敲入靶点中，从而实现外源基因在酵母基因中的定点敲入。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA转录基因是根据酵母基因的靶点序列设计的。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源基因片段的5'端和3'端均含有同源臂序列，所述同源臂序列与酵母靶向基因互为同源臂。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述外源基因片段选自单基因片段或多基因片段。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述携带有Cas9基因和sgRNA转录基因的载体，选自pACT2
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Cas9
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ADE2载体，其制备方法如下：将pACT2
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AD载体利用HindIII限制性内切酶进行酶切处理，去除ADH1启动子与ADH1终止子之间的部分；以CPB载体为模板，使用引物Cas9 F、引物Cas9 R，通过KOD
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Plus高保真酶进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：高惠敏，赵延明，祁显涛，谢传晓，苏成付，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：