一种提高酿酒酵母生产丙二酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高酿酒酵母生产丙二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术以酿酒酵母BY4741为出发菌株，通过将酿酒酵母来源的乙酰辅酶A脱羧酶突变基因和3

【技术实现步骤摘要】
一种提高酿酒酵母生产丙二酸的方法


[0001]本专利技术涉及一种提高酿酒酵母生产丙二酸的方法，属于生物工程领域。

技术介绍

[0002]丙二酸(Malonic acid)又称胡萝卜酸、缩苹果酸或甜菜酸，分子结构中具有活性亚甲基和羧基两种官能团，因而可以参加各种化学反应，是非常重要的有机合成中间体。丙二酸也是美国能源部公布的可以从生物质中生产的前30种化学品之一。
[0003]随着目前国内和国际化工行业的快速发展，加上丙二酸的用途和下游产品的大力开发，丙二酸的产量和品质日剧上升。近几年，随着市场的日趋成熟，消费者对产品的质量要求也越来越高，因此丙二酸的品质指标也需要不断的提升。这就要求现有的生产厂家的在生产能力不断提高的同时，还需要加快丙二酸的生产工艺的技术进步和创新，以及对丙二酸下游产品的研发，从而推动国内和国际上丙二酸行业的快速发展。
[0004]目前工业上常用水解氰乙酸或丙二酸酯的方法制备丙二酸，这些方法在制备过程中都会涉及到氰离子，而氰离子有剧毒，对环境危害大，反应过程复杂，需要经过复杂繁琐的提纯工序，导致产品收率低，原料纯度难以控制，三废处理困难，这些问题极大的限制了工业化生产的产能。
[0005]基于以上问题，越来越多的研究者选择通过细胞工厂生物合成丙二酸。在之前的研究中，Sang等人通过异源表达β
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丙氨酸丙酮酸转氨酶，在大肠杆菌中成功构建了以丙氨酸半醛为前体的丙二酸生产途径，产量达到3.6g/L。但是，以大肠杆菌作为宿主，仍存在菌体耐受性差、大肠杆菌毒性等问题。基于以上问题，越来越多的研究者选择将酿酒酵母作为生物细胞工厂。酿酒酵母是一种最简单的真核生物，其遗传背景清晰、基因操作容易、遗传稳定性强、生命力旺盛、耐酸性和抗逆性强，并且，酿酒酵母可以生产多种类型的有机酸，并且存在着许多支持有机酸合成的内源代谢途径，并且，酿酒酵母是大规模工业发酵生产的最常用菌株之一。这使得酿酒酵母吸引了丙二酸生物合成研究人员的极大的兴趣。其中，Dietrich等人在酿酒酵母中发现，通过EHD3基因进行定点突变，其能够以丙二酰辅酶A为底物，转化为丙二酸，该途径使在酿酒酵母中积累丙二酸成为可能，但是产量较低。

技术实现思路

[0006]基于以上问题，本专利技术利用突变的EHD3基因和突变的乙酰辅酶A脱羧酶基因(ACC1)在酿酒酵母中构建丙二酸生产途径，并将其整合到酿酒酵母delta位点，以通过提高其拷贝数来提高丙二酸产量。
[0007]本专利技术首先提供了一种产丙二酸的重组酿酒酵母，通过构建过表达整合框，过量表达了来自酿酒酵母的乙酰辅酶A脱羧酶的突变体和3
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羟基异丁酰辅酶A水解酶的突变体以及用来筛选delta位点拷贝数的绿色荧光蛋白基因，并将其整合到酿酒酵母BY4741的基因组上。利用绿色荧光蛋白表达的荧光强度来筛选拷贝数相对较高的菌株，从而筛选出丙二酸高产的重组酿酒酵母。
[0008]本专利技术的第一个目的是提供一种产丙二酸的重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的乙酰辅酶A脱羧酶突变体和氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的3
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羟基异丁酰辅酶A水解酶突变体。
[0009]在一种实施方式中，所述过表达为将乙酰辅酶A脱羧酶突变体和3
‑
羟基异丁酰辅酶A水解酶突变体整合至酿酒酵母delta位点。
[0010]在一种实施方式中，编码乙酰辅酶A脱羧酶突变体的基因由启动子UAS1启动表达，编码3
‑
羟基异丁酰辅酶A水解酶突变体的基因由启动子UAS3启动表达。
[0011]在一种实施方式中，所述启动子UAS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述启动子UAS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0012]在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母以酿酒酵母BY4741为出发菌株。
[0013]本专利技术的第二个目的是提供一种构建所述重组酿酒酵母的方法，所述方法为将含有编码乙酰辅酶A脱羧酶突变体基因的表达框IN
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1和含有编码3
‑
羟基异丁酰辅酶A水解酶突变体基因的表达框IN
‑
2整合到酿酒酵母基因组上，构建得到重组酿酒酵母MA
‑
112。
[0014]在一种实施方式中，所述表达框IN
‑
1由Delta1、基因GFP、启动子UAS1、基因ACC1**，终止子T
ADH1
和Ura1段组成，所述表达框IN
‑
2由Ura2、启动子UAS3、基因EHD3***、终止子T
CYC1
和Delta2三个片段组成。
[0015]在一种实施方式中，所述酿酒酵母包括酿酒酵母BY4741。
[0016]本专利技术的第三个目的是提供一种生产丙二酸的方法，所述方法为，以葡萄糖为碳源，利用所述重组酿酒酵母进行发酵。
[0017]在一种实施方式中，将所述重组酿酒酵母的种子液以体积比1～3％的接种量接种到培养基中，于28～30℃培养72～168h。
[0018]在一种实施方式中，所述培养基包括葡萄糖15～25g/L，酵母提取物5～15g/L，蛋白胨15～25g/L。
[0019]本专利技术的第四个目的是提供一种提高酿酒酵母胞外分泌丙二酸的方法，所述方法为过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的乙酰辅酶A脱羧酶突变体和氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的3
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羟基异丁酰辅酶A水解酶突变体。
[0020]在一种实施方式中，所述过表达为将乙酰辅酶A脱羧酶突变体和3
‑
羟基异丁酰辅酶A水解酶突变体整合至酿酒酵母delta位点。
[0021]在一种实施方式中，所述编码乙酰辅酶A脱羧酶突变体的基因由启动子UAS1启动表达，所述3
‑
羟基异丁酰辅酶A水解酶突变体的基因由启动子UAS3启动表达。
[0022]在一种实施方式中，所述启动子UAS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述启动子UAS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0023]在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母以酿酒酵母BY4741为出发菌株。
[0024]本专利技术还提供所述重组酿酒酵母或所述生产丙二酸的方法在制备丙二酸或其衍生产品方面的应用。
[0025]有益效果：
[0026]本专利技术通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的乙酰辅酶A脱羧酶突变体和氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的3
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羟基异丁酰辅酶A水解酶突变体整合至酿酒酵母基因组上，并结合GFP荧光信号对丙二酸代谢途径相关基因的拷贝数进行筛选，最终获得一株高产丙
二酸的组酿酒酵母，该重组酿酒酵母的丙二酸产量达到了80mg/L。
[0027]过表达未进行突变的乙酰辅酶A脱羧酶和3
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羟基异丁酰辅酶A水解酶的重组酿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产丙二酸的重组酿酒酵母，其特征在于，过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的乙酰辅酶A脱羧酶突变体和氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的3
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羟基异丁酰辅酶A水解酶突变体。2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母，其特征在于，编码乙酰辅酶A脱羧酶突变体的基因由启动子UAS1启动表达，3
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羟基异丁酰辅酶A水解酶突变体的基因由启动子UAS3启动表达。3.根据权利要求2所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述启动子UAS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述启动子UAS3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。4.根据权利要求1～3任一所述的重组酿酒酵母，其特征在于，所述重组酿酒酵母以酿酒酵母BY4741为出发菌株。5.一种生产丙二酸的方法，其特征在于，所述方法为以葡萄糖为碳源，利用权利要求1～4任一所述重组酿酒酵母进行发酵。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓禹，赵运英，李诗韵，周胜虎，李国辉，毛银，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：