逆转肿瘤微环境抑制性信号的NK细胞制备方法及应用技术

本发明专利技术提出一种能够逆转肿瘤微环境免疫抑制信号的免疫细胞制备方法及其应用。其中，所述逆转抑制性信号的方法是将TIGIT受体的胞内段替换为4

【技术实现步骤摘要】
逆转肿瘤微环境抑制性信号的NK细胞制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体地，本专利技术涉及一种CAR
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免疫细胞的制备及其在肿瘤治疗中的用途，更具体地，本专利技术涉及一种逆转肿瘤微环境抑制性信号的嵌合抗原受体、表达载体、转基因免疫细胞、药物组合物的制备方法及其用途。

技术介绍

[0002]近年来，免疫疗法在肿瘤治疗领域取得了令人瞩目的进展，尤其是以抗CTLA
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4和抗PD
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1或PD
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L1抗体为代表的免疫卡控点阻断疗法。通过阻断T细胞表面抑制性受体与其配体的结合，阻断抑制性信号的传递，纠正免疫抑制性微环境所介导的免疫抑制，恢复肿瘤微环境T细胞的抗肿瘤能力，在多种转移性晚期癌症(包括转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等)治疗方面取得了较高的应答率，使众多原本已经失去治疗机会的对放化疗无效的晚期癌症患者有了重新治疗的希望。
[0003]然而，并非所有的恶性肿瘤患者对PD
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1、PD
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L1或CTLA
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4阻断治疗有效，对PD
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1或PD
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L1抗体的治疗只有10％
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30％的患者表现出长期持久的反应，大多数人群缺乏响应，改善临床响应及克服耐药是该领域面临的最大挑战。探究肿瘤对免疫卡控阻断治疗不应答的机制，寻找其他影响免疫细胞功能的免疫调控卡点，成为肿瘤免疫治疗领域亟待解决的问题。目前，越来越多的免疫卡控点分子被发现并开发应用。
[0004]T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(TIGIT)作为一个重要的免疫卡控点，主要表达在自然杀伤(NK)细胞、活化的CD8+T和CD4+T细胞、调节性T细胞(Tregs)和滤泡辅助性T细胞(Tfh)表面。TIGIT识别的配体CD155和CD112主要在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)、T细胞、B细胞和许多非造血细胞(包括不同组织学类型的肿瘤细胞)上表达。TIGIT结合CD155的亲和力显著高于其竞争受体CD226和CD96。TIGIT与其配体结合后向T细胞或NK细胞传递抑制性信号。研究发现TIGIT在多种恶性肿瘤(如非小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌、肝癌、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病和滤泡性淋巴瘤)的T细胞或NK细胞高表达。TIGIT的配体CD155高表达于多种实体瘤和血液肿瘤，包括肝癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、头颈癌、乳腺癌、淋巴瘤、白血病等。TIGIT与CD155的表达丰度与患者预后密切相关。目前的的治疗方法是通过开发靶向TIGIT单抗有效地恢复T细胞或NK细胞功能，进而发挥杀伤肿瘤作用。其中，一些生物技术/制药公司(如罗氏、百济神州、复宏汉霖等)正在致力于开发抗TIGIT的抗体，相关产品处于不同的临床开发阶段。但是，临床试验结果表明，单独使用TIGIT抗体治疗效果并不理想，需与PD
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1或PD
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L1抗体等联合应用才可改善其效果，罗氏和百济神州开发的抗TIGIT单抗与PD
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L1抗体联合用于非小细胞肺癌的治疗已经进入III期临床试验。
[0005]因此，TIGIT及其配体CD155有望成为肿瘤免疫治疗的新靶点，阻断免疫细胞表面TIGIT抑制性信号的传递，在肿瘤免疫治疗中具有巨大的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0007]为了能够提高肿瘤的杀伤效果以及减少外用药物所带来的副作用，本专利技术提供了一种能够选择性逆转免疫卡控点TIGIT抑制性信号的免疫细胞制备方法及其在恶性肿瘤治疗中的应用。
[0008]本专利技术所提供的逆转免疫卡控点TIGIT抑制性信号的免疫细胞制备方法为，构建靶向TIGIT配体的嵌合抗原受体，其胞外段为TIGIT胞外段、其跨膜区为TIGIT跨膜区、其胞内段为4
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1BB共刺激信号域、IL18RB胞内段与CD3ζ胞内区。该结构能够将TIGIT识别其配体CD155的抑制性信号转化为4
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1BB、IL
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18R和CD3介导的共刺激活化信号，从而将NK细胞接收到的来自肿瘤微环境的抑制性信号转换为激活信号，有效增强免疫细胞的杀伤肿瘤活性，可应用于TIGIT配体高表达的多种恶性肿瘤的治疗。专利技术人发现，当胞内段为4
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1BB共刺激信号域、IL18RB胞内段与CD3ζ胞内区时，较胞内段为4
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1BB共刺激信号域、IL21R胞内段与CD3ζ胞内区，其激活的共刺激信号更强，能够激发NK细胞对TIGIT配体阳性细胞更强的的杀伤活性。
[0009]因此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种嵌合抗原受体。根据本专利技术的实施例，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括TIGIT胞外段；跨膜区，所述跨膜区包括TIGIT跨膜区，并且嵌入到所述细胞细胞膜中；胞内区，所述胞内区包括4
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1BB共刺激因子结构域、IL18RB胞内段与CD3ζ胞内信号段，其中，所述胞外区的C端与所述跨膜区的N端相连，所述跨膜区的C端与所述胞内区的N端相连。将本专利技术实施例中所述的嵌合抗原受体导入免疫细胞中表达。其中，所述原本T细胞或NK细胞收到的免疫抑制信号转换为激活信号，有效提高免疫细胞的杀伤肿瘤效果。
[0010]根据本专利技术的实施例，上述嵌合抗原受体还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
[0011]根据本专利技术实施例，所述嵌合抗原受体中4
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1BB共刺激因子结构域的C端与所述IL18RB胞内段的N端相连，所述IL18RB胞内段的C端与所述CD3ζ胞内信号段的N端相连。进而表达该嵌合抗原受体的免疫细胞的免疫激活效应更强。
[0012]根据本专利技术的实施例，所述胞外区能够结合配体，所述配体包括PVR家族成员中的至少之一。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述PVR家族成员包括CD155和CD112。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述PVR家族成员为CD155。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述TIGIT胞外段具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述TIGIT跨膜区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述4
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1BB共刺激因子结构域具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述IL18RB胞内段具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述CD3ζ胞内信号段具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
[0020]根据本专利技术的实施例，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
[0021]MRWCLLLIWAQGLR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括：胞外区，所述胞外区包括TIGIT胞外段；跨膜区，所述跨膜区包括TIGIT跨膜区，并且嵌入到所述细胞细胞膜中；以及胞内区，所述胞内区包括4
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1BB共刺激因子结构域、IL18RB胞内段与CD3ζ胞内信号段；其中，所述胞外区的C端与所述跨膜区的N端相连，所述跨膜区的C端与所述胞内区的N端相连。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述4
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1BB共刺激因子结构域的C端与所述IL18RB胞内段的N端相连，所述IL18RB胞内段的C端与所述CD3ζ胞内信号段的N端相连。3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外区能够结合配体，所述配体包括PVR家族成员中的至少之一；任选地，所述PVR家族成员包括CD155和CD112；优选地，所述PVR家族成员为CD155。4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述TIGIT胞外段具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述TIGIT跨膜区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；所述4
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1BB共刺激因子结构域具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；所述IL18RB胞内段具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述CD3ζ胞内信号段具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。5.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体。6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。7.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求5或6所述的核酸分子。8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，进一步包括：启动子，所述启动子与权利要求5或6所述的核酸分子可操作地连接。9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述启动子选自CMV,EF
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1,RSV的至少之一。10.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是非致病性病毒载体。11.根据权利要求10所述的表达载体，其特征在于，所述非致病性病毒选自反转录病毒、慢病毒和腺病毒相关病毒，优选地，所述非致病性病毒为慢病毒。12....

【专利技术属性】
技术研发人员：张彩，胡渊，陈敏华，王烃，谢思奇，伏永玲，
申请(专利权)人：上海恩凯细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：