一种多接头自组装蛋白纳米颗粒的制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种多接头自组装蛋白纳米颗粒的制备方法与应用，属于纳米材料技术领域。其主要是利用基因工程方法将具有自组装功能的IMX313蛋白的N端和C端分别连接SpyCatcher接头，通过大肠杆菌表达系统进行重组表达并纯化得到具有多接头的自组装蛋白纳米颗粒。本发明专利技术得到的蛋白纳米颗粒可以利用SpyTag/SpyCatcher能够自发形成分子间异肽键来连接具有SpyTag标签的目标蛋白，可用于多价疫苗和多酶复合体的制备以及作为药物递送载体使用。多酶复合体的制备以及作为药物递送载体使用。

【技术实现步骤摘要】
一种多接头自组装蛋白纳米颗粒的制备方法与应用


[0001]本专利技术属于纳米材料
，具体涉及一种多接头自组装蛋白纳米颗粒的制备方法与应用。

技术介绍

[0002]随着技术的发展，出现了一些经过人工设计的、非天然的工程化蛋白纳米颗粒并发展出了相应的自组装方法和技术。目前，目标蛋白主要通过和纳米颗粒蛋白进行融合表达来制备相应的蛋白纳米颗粒，缺少通用性，随着蛋白纳米颗粒的应用越来越多，IMX313是由55个氨基酸构成的一个小的蛋白质结构域，可自组装成同源七聚体纳米颗粒。IMX313由两种鸡补体4结合蛋白(C4bp)的寡聚化结构域的杂交体，两者都是人C4bp的远距离同源物，同时发挥佐剂样作用，提高抗体对融合蛋白抗原的反应。同时IMX313七聚体纳米颗粒具有很高的热稳定性，可将其开发作为一种通用的蛋白纳米颗粒载体平台使用。临床前疫苗开发表明，小鼠接种了无性红内体疟疾候选疫苗疟原虫(P.yoelii)MSP119与IMX313融合蛋白后受到致死剂量的攻击保护。在小鼠和非人类灵长类动物研究中，为了努力提高MVA85A的免疫原性，将MVA85A与IMX313相结合，在IMX313提高了MVA85A的免疫原性。最近在牛津的I期临床试验中对IMX313进行了测试，作为候选结核病疫苗MVA85A
‑
IMX313的一部分，证明具有良好的安全性和免疫原性特征。类似地，在小鼠研究中，将主要的疟疾TBV候选抗原Pfs25与IMX313融合并在重组复制缺陷型黑猩猩腺病毒63型(ChAd63)和减毒痘苗病毒MVA病毒载体中表达，表现出比编码单体Pfs25的载体具有显着更高的免疫原性和显著更好的降低传播活性，使其成为高度有希望的TBV候选疫苗。近期对病毒载体疫苗ChAd63 Pfs25
‑
IMX313和MVA Pfs25
‑
IMX313进行了I期临床试验，结果表明这些疫苗在未感染疟疾的成人中表现出良好的安全性，并且可以通过人类免疫诱导抗Pfs25特异性抗体反应和免疫反应。然而疫苗诱导的血清抗体显示出较弱的传播阻断活性，突出表明需要进一步深入评估由该候选疫苗诱导的人类免疫反应。在鱼疫苗的研究中，将链球菌的α
‑
烯醇化酶与IMX313融合进行寡聚化，用烯醇化酶
‑
IMX313免疫的鱼比用α
‑
烯醇化酶免疫的鱼存活率要高，这表明抗原与IMX313融合可能是一种提高亚单位疫苗保护效力有效的方法。
[0003]要使一种蛋白纳米颗粒作为一种通用的载体平台来使用，必须在其表面引入可以共价连接目标蛋白的接头。SpyTag/SpyCatcher系统是由Howarth实验室基于Streptococcus pyogenes纤粘连蛋白FbaB的CnaB2结构域的内部异肽键开发的。在该结构域中，赖氨酸K3的ε
‑
氨基和天冬氨酸D117的侧链羧基之间自发形成内部异肽键，所得异肽键赋予CnaB2结构域高稳定性。CnaB2结构域可以稳定地分成两部分：一个较大的、不完整的免疫球蛋白样结构域(SpyCatcher)，包含138个残基(15kDa)；一个较短的肽(SpyTag)，包含13个残基。SpyCatcher包含活性赖氨酸和催化谷氨酸，而SpyTag包含活性天冬氨酸，这两种成分具有高亲和力，可以相互识别，并且可以在SpyCatcher和SpyTag之间生成异肽键从而形成共价结合的复合物。SpyTag在大小上与许多表位标签相当，可以在基因上融合到许多蛋白质上，并且当插入到目标蛋白质的N端或C端以及内部位点时，能够与SpyCatcher发生
反应。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是通过基因工程方法设计一种可在其表面通过共价连接引入目标蛋白的蛋白纳米颗粒，并在大肠杆菌中实现其高效表达和分离、纯化，达到可以实际应用的水平，为制备功能性蛋白纳米颗粒提供一个有效、廉价的载体平台，本专利技术具有重要的实用意义，尤其是对多价蛋白纳米颗粒疫苗和多酶复合体的制备以及蛋白类药物的递送具有重要的实用价值。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下措施来达到：
[0006]人工合成SpC
‑
IMX313
‑
SpC基因序列，在其N端加入起始密码子ATG，并对基因的密码子按大肠杆菌密码子偏爱性进行优化，其DNA序列及氨基酸序列如下：
[0007][0008][0009]将人工合成的SpC
‑
IMX313
‑
SpC基因序列克隆至商业化表达载体pET
‑
3a的Nde I和BamH I位点之间，转化BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，上清中的表达产物经镍柱亲和纯化，最终获得重组SpC
‑
IMX313
‑
SpC蛋白。该蛋白在天然状态下为七聚体，能够作为蛋白纳米颗粒载体平台在其表面展示各种目标蛋白。
[0010]本专利技术同已有的商业化的蛋白纳米颗粒不同之处在于，通过在其表面引入连接臂，利用SpyTag/SpyCatcher共价偶联系统可以在其表面连接目标蛋白。当利用其共价偶联抗原制备蛋白纳米颗粒疫苗时，IMX313可以发挥佐剂样功能，增强机体对抗原的免疫应答，同时每个纳米颗粒含有14个接头，可以同时偶联14种抗原，便于制备多价疫苗。在制备多酶复合物时，利用其多接头可以根据多酶反应体系中每种酶的活力不同调整偶联比例，使得
多酶反应体系中各种酶的活力能够互相匹配，提高酶的催化效率。在作为药物递送载体使用时，SpC
‑
IMX313
‑
SpC蛋白纳米颗粒可以同时偶联具有定位功能的蛋白和药物蛋白，使药物具有靶向性，提高药物在体内的稳定性。
[0011]本专利技术的用途能够作为一种蛋白纳米颗粒在其表面共价连接展示多种目标蛋白，适用于疫苗工程、酶工程、生物工程制药等研究。
附图说明
[0012]图1是重组质粒pET3a
‑
SpC
‑
IMX313
‑
SpC的示意图。
[0013]图2是工程菌pET3a
‑
SpC
‑
IMX
‑
SpC/BL21(DE3)表达与纯化的SDS
‑
PAGE分析。其中：泳道1为pET
‑
3a/BL(DE3)诱导后全菌；泳道2
‑
4分别为pET3a
‑
SpC
‑
IMX313
‑
SpC/BL21(DE3)诱导后的全菌、上清和沉淀；5
‑
7分别为超声上清经镍柱纯化的穿透、清洗和洗脱样品。
[0014]图3是双抗原表位蛋白纳米颗粒的制备。
[0015]图4是双酶复合体蛋白纳米颗粒的制备。
具体实施方式
[0016]以下结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而不用于限定本专利技术的范围本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多接头自组装蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将SpyCatcher和IMX313通过柔性Linker连接并在N端融合His
‑
Tag标签，连接顺序为6
×
His
‑
SpyCatcher
‑
Linker1
‑
IMX313
‑
Linker2
‑
SpyCatcher，简称为SpC
‑
IMX313
‑
SpC，其序列如SEQ ID NO.2所示；(2)将上述SpC
‑
IMX313
‑
SpC对应的基因序列SEQ ID NO.1克隆至pET
‑
3a质粒得到重组表达质粒pET3a
‑
SpC
‑
IMX313
‑
SpC并转入E.coil BL 21(DE3)获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：钮利喜，冀娇，石亚伟，李思，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：