一种重组组织因子rhTF突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属生物技术工程领域，提供了一种重组组织因子rhTF突变体及其应用，重组组织因子突变体为：rhTF突变体A，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示突变位点：T17F、I22R、S47R、T112W、S188R、V207R六个位点同时突变，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；或rhTF突变体B，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示突变位点：T17F、I22R、S47F、T112W、S188K、V207K六个位点同时突变，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。有较高的促凝血活性和较好的热稳定性，用于生物医药、临床凝血酶原时间测定和外伤的创面止血等。原时间测定和外伤的创面止血等。原时间测定和外伤的创面止血等。

【技术实现步骤摘要】
一种重组组织因子rhTF突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术工程领域，具体涉及一种重组组织因子rhTF突变体及其应用。

技术介绍

[0002]组织因子(tissue factor，TF)即凝血Ⅲ因子，也称CD142，是一种跨膜糖蛋白,分子量为47kD。组织因子成熟分子由263个氨基酸残基构成，包括219个氨基酸组成的胞外区、23个氨基酸残基组成的疏水性跨膜区和由21个氨基酸残基组成的胞质内区，其中胞外区是组织因子的功能区域。
[0003]组织因子是凝血因子
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的受体和辅助因子，是外源凝血途径的启动蛋白。正常生理状态下，组织因子存在于血管外组织，包括血管壁外膜细胞，包绕血管的成纤维细胞，肝、脾、肾等器官的纤维囊，及皮肤外层的表皮细胞、肾小球上皮细胞、脑皮质、心肌细胞、肺泡巨噬细胞、胃肠道壁、部分生殖泌尿道和子宫内膜基质细胞中，组织因子不与循环血液接触。当血管破损后，血管壁的完整性遭到破坏，组织因子暴露于循环血液中，与血液中凝血因子VII结合形成复合物，激活凝血因子
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，进一步活化凝血酶，最终活化纤维蛋白形成凝血，达到生理性止血的目的。
[0004]组织因子作为外源性凝血系统的启动蛋白，不仅通过与因子
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a 结合而启动血液凝固级联反应，而且依靠组织因子与细胞膜的紧密结合发挥“锚”作用，使生理性凝血过程局限于损伤部位。同时，组织因子对创伤愈合，血管生成，组织重塑及炎症反应也起着重要作用。因此，组织因子作为一种重要的活性蛋白，在生物医药、临床凝血酶原时间测定和创伤止血中具有重要的应用价值。
[0005]天然组织因子主要存在于细胞膜上，难以从组织细胞中大量提取和制备。在凝血酶原时间测定和止血材料的应用上，人们从人脑、人胎盘和兔脑粉中采用化学的方法提取分离组织因子，用于制备凝血酶原时间（PT）测定试剂，但由于组织来源不同，以及不同种属来源的组织因子对凝血因子的反应敏感度也不同，导致化学提取的组织因子敏感性低、稳定性差；随着现代生物技术的发展，人们利用基因工程的手段，通过大肠杆菌和真核细胞重组表达组织因子，获得了较好的重组组织因子，解决了组织因子的来源问题。应用于临床凝血酶原时间测定试剂的生产，有效提高了试剂的敏感性和稳定性；应用于二氧化硅的胶原蛋白水凝胶、淀粉微粒和壳聚糖等的复合止血材料中，达到局部快速止血的效果。
[0006]但在实际应用过程中，重组组织因子的活性和稳定性是重要的指标。在凝血酶原时间测定试剂生产中，重组组织因子作为主要成分，其凝血活性的高低直接反应了试剂的敏感性，高活性的重组组织因子能够准确地反应凝血因子的水平；其次，凝血酶原时间测试过程中，试剂长时间在37℃的条件下预热，重组组织因子的耐热稳定性又是试剂稳定性的重要指标。另外，作为一种外伤用止血材料，首先具有较好的止血活性和较长的效期，重组组织因子直接参与了血液凝固的全过程，在外伤止血材料中具有较好的应用前景，但自身的活性和稳定性成为应用的关键问题。因此，获得一种高凝血活性和热稳定性好的重组组
织因子，可有效解决组织因子应用的瓶颈问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种重组组织因子rhTF突变体及其应用，获得一种高凝血活性和热稳定性好的重组组织因子突变体，更好地应用和推广，提高凝血酶原时间测定试剂的敏感性和稳定性，提高复合止血材料的止血效果及其有效期。
[0008]本专利技术由如下技术方案实现的：一种重组组织因子rhTF突变体，所述重组组织因子突变体为：rhTF突变体A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；或rhTF突变体B，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0009]所述重组组织因子rhTF是在来源于人胎盘的TF的基础上，在N端加上纯化标签6HIS获得的rhTF，其中：人胎盘的TF氨基酸序列SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列SEQ ID NO.2所示。
[0010]所述rhTF突变体是将如SEQ ID NO.1所示的rhTF氨基酸序列中第17位、第22位、第47位、第112位、第188位、第207位的氨基酸同时进行多位点的突变，突变位点的编号按照SEQ ID NO.1所示rhTF去掉N端6HIS的纯化标签后进行编号。
[0011]所述的rhTF突变体为下面a突变或b突变中的任一突变：a、将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的重组组织因子rhTF的六个位点同时突变，分别为第17位苏氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为T17F；第22位异亮氨酸突变为精氨酸得到的，命名为I22R；第47位丝氨酸突变为精氨酸得到的，命名为S47R；第112位苏氨酸突变为色氨酸得到的，命名为T112W；第188位丝氨酸突变为精氨酸得到的，命名为S188R；第207位缬氨酸突变为精氨酸得到的，命名为V207R；该突变体命名为重组组织因子rhTF突变体A；b、将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的重组组织因子rhTF的六个位点同时突变，分别为第17位苏氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为T17F；第22位异亮氨酸突变为精氨酸得到的，命名为I22R；第47位丝氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为S47F；第112位苏氨酸突变为色氨酸得到的，命名为T112W；第188位丝氨酸突变为赖氨酸得到的，命名为S188K；第207位缬氨酸突变为赖氨酸得到的，命名为V207K；该突变体命名为重组组织因子rhTF突变体B。
[0012]所述重组组织因子rhTF突变体A的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；所述的重组组织因子rhTF突变体B的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0013]所述的重组组织因子rhTF突变体在制备临床凝血酶原时间测定试剂和制备外伤的创面止血药物中的应用。
[0014]制备所述重组组织因子rhTF突变体的方法，基于TF 与因子VIIa复合物晶体结构的基础上，使用Discovery Studio (2017R1) 进行分子模拟对接和突变筛选，依据能量计算结果，获得了能量最低的突变体A：T17F、I22R、S47R、T112W、S188R、V207R，和突变体B：T17F、I22R、S47F、T112W、S188K、V207K；利用结构分析和分子间相互作用分析，得到重组组织因子突变体。
[0015]本专利技术提供了一种重组组织因子rhTF及其突变体，实现了重组组织因子rhTF及其突变体在大肠杆菌的表达，建立了凝血酶原时间测定重组组织因子rhTF及其突变体的活性分析方法，进行了活性和热稳定性的分析比较。本专利技术重组组织因子rhTF突变体的活性较重组组织因子rhTF活性有了明显的提高，在凝血酶原时间的测定中，突变体蛋白浓度
6.25ng/ml和重组蛋白浓度12.5ng/ml的PT值相当。重组组织因子rhTF突变体热稳定性较重组组织因子rhTF的热稳定性有较大的提高，在37℃条件下，突变体第1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组组织因子rhTF突变体，其特征在于：所述重组组织因子突变体为：rhTF突变体A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；或rhTF突变体B，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。2.根据权利要求1所述的一种重组组织因子rhTF突变体，其特征在于：所述重组组织因子rhTF是在来源于人胎盘的TF的基础上，在N端加上纯化标签6HIS获得的rhTF，其中：人胎盘的TF氨基酸序列SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的一种重组组织因子rhTF突变体，其特征在于：所述rhTF突变体是将如SEQ ID NO.1所示的rhTF氨基酸序列中第17位、第22位、第47位、第112位、第188位、第207位的氨基酸同时进行多位点的突变，突变位点的编号按照SEQ ID NO.1所示rhTF去掉N端6HIS的纯化标签后进行编号。4.根据权利要求3所述的一种重组组织因子rhTF突变体，其特征在于：所述的rhTF突变体为下面a突变或b突变中的任一突变：a、将如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的重组组织因子rhTF的六个位点同时突变，分别为第17位苏氨酸突变为苯丙氨酸得到的，命名为T17F；第22位异亮氨酸突变为精氨酸得到的，命名为I22R；第47位丝氨酸突变为精氨酸得到的，命名为S47R；第112位苏氨酸突变为色氨酸得到的，命名为T112W；第188位丝氨酸突变为精氨酸得到的，命名为S188R；第2...

【专利技术属性】
技术研发人员：师融，郝建建，王文明，王志军，
申请(专利权)人：山西博鑫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：