一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件及应用方法技术

本发明专利技术公开了一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，所述标记套件由10对微卫星引物组成，每对引物的正向引物的5

【技术实现步骤摘要】
一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件及应用方法


[0001]本专利技术属于水产动物繁殖育种
，具体涉及一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件及应用方法。

技术介绍

[0002]克氏原螯虾(Procambarus clarkii),隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、螯虾科、原螯虾属，俗称小龙虾、淡水小龙虾等。由于其适应性强、肉质鲜美、营养丰富等突出特点而受到人们的青睐。目前，克氏原螯虾已成为我国重要的淡水经济养殖品种。尽管克氏原螯虾在我国已经得到广泛的养殖，但其种业的发展相较于产业发展仍相对滞后。当前克氏原螯虾的苗种繁育以自繁为主，自繁自育、多代同田(塘)导致长期近亲繁殖及捕大留小的逆向选择，造成克氏原螯虾规格小、生长速度缓慢、抗逆性下降等种质退化问题。在家系选育或综合选育的过程中，保持完整、准确的系谱信息可以有效地指导育种亲本的选择和配对，从而促进亲本配合力的提高和避免近交衰退。而为了更准确地评价家系生长性能、杂交优势和遗传参数，需要进行不同家系的混养，以减少环境因素的影响，但最终还是需要对混养的家系进行区分。传统的通过物理标记进行家系区分的方法存在成本高、费时费力、标记后易脱落、难以弥补、持续时间短等缺点。因此，建立有效的亲缘关系鉴定和谱系管理技术，是保护克氏原螯虾种质资源、避免选育过程中出现近交衰退的迫切技术手段。
[0003]微卫星DNA是由2
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6个核苷酸串联组成的重复序列，广泛分布在真核生物的基因组中。由于其具有稳定性好、多态信息含量丰富、孟德尔分离、共显性遗传和易于基因分型等优点，被认为是理想的分子标记。目前，微卫星标记已广泛应用于种群结构的研究、谱系追踪、亲子鉴定等方面。文献中报道的克氏原螯虾的大多数微卫星是二核苷酸重复序列，其在PCR扩增反应过程中可因链滑脱而产生比目的片段少2bp的杂带，电泳时会产生“影子带”，它的存在使基因型的表征复杂化。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件及应用方法。本专利技术利用高度多态的四碱基微卫星位点的荧光标记引物和荧光基因分型进行家系的亲缘关系鉴定，为克氏原螯虾的遗传选育和防止近亲交配提供了一套可靠高效的检测平台。
[0005]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0006]本专利技术提供的一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，由10对微卫星引物对组成，所述微卫星引物对的序列如下：
[0007][0008]进一步地，所述微卫星引物对的核心序列均为四碱基重复。
[0009]进一步地，所述微卫星引物对的正向引物5
’
端进行荧光基团修饰，所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX。
[0010]进一步地，所述微卫星引物对的核心序列重复单元、最适退火温度、产物大小和每对正向引物5
’
端的荧光基团修饰如下表：
[0011]表1克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件所包含的微卫星引物信息
[0012][0013][0014]本专利技术还提供了一种基于微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定方法，包括以下步骤：
[0015](1)克氏原螯虾亲本与子代基因组DNA提取；
[0016](2)以提取的DNA为模板，进行荧光引物的PCR扩增；
[0017](3)基因分型：PCR扩增产物在ABI 3730XL遗传分析仪上进行分离，利用GeneMarker v1.75软件读取各个体在各微卫星位点的基因型；
[0018](4)亲子鉴定：采用Cervus v3.0软件计算子代个体与候选亲本的似然率对数值(LOD)，LOD值最高的候选亲本被认为是最可能的亲本。
[0019]作为优选方案，所述步骤(1)中，采用醋酸铵法提取亲本和子代的基因组DNA。
[0020]作为优选方案，所述步骤(2)中，PCR反应体系为：总体积10μL：PCR Mix 5μL，正反引物(10μM)各0.25μL，DNA模板(100ng/μL)0.5μL，ddH2O 4μL。
[0021]作为优选方案，所述步骤(2)中，PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，最适退火温度(表1)下退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0023](1)本专利技术所选的微卫星位点具有高度的多态性，利用少数位点即可在克氏原螯虾亲子鉴定中得到较好的鉴定效果；
[0024](2)本专利技术所选用的均为四碱基重复标记，PCR扩增过程中不易产生“影子带”，稳定性高，具有更好的检测准确度；
[0025](3)本专利技术采用了荧光基因分型的方法，等位基因判读更加准确，且可将不同荧光修饰引物的PCR扩增产物混合后检测，极大地节省了基因分型的费用；
[0026](4)本专利技术克服了传统物理标记的局限性，为克氏原螯虾的遗传选育和防止近亲交配提供了一套可靠高效的检测平台。
附图说明
[0027]图1为本专利技术实施例2中部分位点的基因分型峰图。
[0028]图2为本专利技术实施例2中亲子鉴定实际累积鉴定准确率。
具体实施方式
[0029]为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施例。本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样在本申请所列权利要求书限定范围之内。
[0030]实施例1
[0031]用于克氏原螯虾亲子鉴定的微卫星位点的筛选
[0032]从本实验室开发的克氏原螯虾微卫星标记中选择具有较高多态性的四碱基重复位点16个，分别为：PC4
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G98、PC4
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G123、PC4
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T1、PC4
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G110、PC4
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G97、PC4
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G119、PC4
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G81、PC4
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G48、PC4
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G28、PC4
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G10、PC4
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G6、PC4
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G2、PC4
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G4、PC4
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G19、PC4
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G13、PC4
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G40。从已发表的文章中选择四碱基重复位点2个，分别为：PclG
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03、PclG
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07。上述微卫星位点引物对的正向引物5
’
端分别用FAM、HEX、ROX进行荧光修饰并合成。
[0033]合成的18对荧光引物在90个个体上得到扩增并进行基因分型，以评估这些位点用于亲子鉴定的效率。PCR反应体系为10μL，包括PCR Mix(翌圣，上海，中国)5μL，正反引物(10μM)各0.25μL，DNA模板本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，其特征在于：所述标记套件由10对微卫星引物对组成，所述微卫星引物对的序列如下：2.根据权利要求1所述的一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，其特征在于：所述微卫星引物对的核心序列均为四碱基重复。3.根据权利要求1所述的一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，其特征在于：所述微卫星引物对的正向引物5
’
端进行荧光基团修饰，所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX。4.根据权利要求1所述的一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，其特征在于：所述微卫星引物对的核心序列重复单元、最适退火温度、产物大小和每对正向引物5
’
端的荧光基团修饰如下表：表1克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件所包含的微卫星引物信息
5.一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定方法，采用如权利要求1
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4任一项所述的标记套件，其特征在于：所述方法包括以下步骤：(1)克氏原螯虾亲本与子代基因组DNA提取；(2)以提取的DNA为模板，进行10对微卫星引物对的PCR扩增；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王齐帅，李艳和，胡倩，杨思琦，王卫民，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：