转基因免疫细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提出一种转基因免疫细胞及其应用，所述免疫细胞表达嵌合抗原受体以及免疫刺激分子，所述免疫刺激分子包括IL

【技术实现步骤摘要】
转基因免疫细胞及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及转基因免疫细胞及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptorT，CAR
‑
T)细胞在血液恶性肿瘤治疗中取得了令人瞩目的效果。但是CAR
‑
T细胞在临床应用中易产生细胞因子风暴、神经毒性、GVHD等不良反应，而且，CAR
‑
T细胞对实体瘤的治疗效果尚不理想，使得CAR
‑
T细胞的临床应用仍面临挑战。
[0003]CAR
‑
NK细胞较CAR
‑
T细胞具有安全性好的优势，一般不会引起细胞因子风暴和GVHD等副作用；且NK细胞不需要抗原递呈、不受MHC限制，即可发挥直接的杀伤肿瘤细胞的作用；CAR
‑
NK细胞可以以CAR依赖和NKR依赖等多种识别机制识别和杀伤肿瘤，抗瘤谱广。因此，CAR
‑
NK细胞在抗肿瘤治疗中具有广泛的应用前景，已成为细胞免疫治疗研发领域的热点。然而，CAR
‑
NK细胞研发过程中面临的难题之一是NK细胞在体内的存活时间较短，影响了其在体内效应的发挥。
[0004]IL
‑
15为一种能促进T细胞和NK细胞存活、增殖和功能的细胞因子，IL
‑
15与IL
‑
2共用IL
‑
2/15Rβγc受体，IL
‑
15和IL
‑
15Rα形成二聚体后结合IL
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15Rβγc激活下游JAK1/JAK3和STAT3/STAT5信号通路，进而促进NK细胞的增殖、活化和效应功能。因此，IL
‑
15已成为增强淋巴细胞在体内的持久性和增殖活性的药物研发热门靶点。
[0005]但是，IL
‑
15在体内应用存在的问题是半衰期短、体内药效有限，需要使用较大的剂量，且要频繁施用，导致各种副作用，包括低血压、血小板减少、AST与ALT升高等，这可能导致癌症患者不能耐受这种治疗。临床应用和药物研发中应尽量保持IL
‑
15的促进淋巴细胞增殖与持久性及促进免疫应答的活性，同时尽可能降低IL15相关的副作用。
[0006]基于以上研究和开发现状，有待于进一步研究安全有效的提高CAR
‑
NK细胞体内持久性的方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术提出了一种转基因免疫细胞，其增殖能力和体内存活时间，以及其抗肿瘤能力都较天然的免疫细胞得到显著提高，且具有更高的安全性。
[0008]因此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种转基因免疫细胞。根据本专利技术的实施例，所述免疫细胞表达嵌合抗原受体以及免疫刺激分子，所述免疫刺激分子包括IL
‑
15。根据本专利技术实施例的所述转基因免疫细胞能够同时表达和分泌嵌合抗原受体和免疫刺激分子。其中，所述嵌合抗原受体能够使得免疫细胞靶向对应抗原，定位至表达所述抗原的细胞表面，此外，所述免疫刺激分子进一步促进免疫细胞的活化和增殖，维持免疫细胞在肿瘤局部微环境中的数量和活性，使其保持强大的肿瘤杀伤活性，能够有效避免全身高剂量或反复多次注射带来的毒副作用。
[0009]根据本专利技术的实施例，上述转基因免疫细胞还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
[0010]根据本专利技术的实施例，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区能够与抗原特异性结合；跨膜区；以及胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段和信号转导结构域；其中，所述胞外区的C端与所述跨膜区的N端相连，所述跨膜区的C端与所述胞内区的N端相连。本申请中，所述嵌合抗原受体识别的抗原种类不受特别限制，适用于特异性识别多种抗原。
[0011]根据本专利技术的实施例，所述抗原是肿瘤相关抗原。根据专利技术的一些具体实施例，所述抗原的种类不受特别限制。
[0012]根据本专利技术的实施例，所述胞外区包括抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体结合所述抗原。本领域技术人员可以理解，所述胞外区包括识别所述抗原的结合区即可，所述胞外区可以包括全抗抗体、Fab抗体、Fab
’
抗体、F(ab
’
)2抗体、Fv抗体、单链抗体以及纳米抗体中的至少之一。根据本专利技术的一些优选的实施例，所述胞外区包括单链抗体。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述抗原包括选自间皮素、HER2、EGFR、GPC3、MUC1、CEA、CLDN 18.2、EpCAM、GD2、PSCA、CD133、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA中的至少之一。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述抗原为间皮素。根据本专利技术的一些具体实施例，当所述抗原为间皮素时，所述转基因免疫细胞能够有效靶向间皮素阳性肿瘤，并保留较高的增殖活性，具有较高的抗肿瘤能力。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述胞外区包括抗间皮素单链抗体。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述抗间皮素单链抗体包括抗间皮素抗体的轻链可变区、连接肽1以及抗间皮素抗体的重链可变区。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述连接肽1具有(GGGGS)n所示的氨基酸序列，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
[0018]根据本专利技术的实施例，抗间皮素单链抗体包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些具体的实施例中，当所述抗间皮素单链抗体具有上述氨基酸序列时，所述转基因免疫细胞能够有效靶向间皮素阳性肿瘤，并保留较高的增殖活性，具有较高的抗肿瘤能力。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述胞外区进一步包括铰链区片段，所述铰链区片段的N端与所述单链抗体的C端相连。
[0020]根据本专利技术的实施例，所述铰链区片段包括选自CD8、CD28和免疫球蛋白的铰链区中的至少之一。
[0021]根据本专利技术的实施例，所述铰链片段包括CD8的铰链区。
[0022]根据本专利技术的实施例，所述铰链片段包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
[0023]根据本专利技术的实施例，所述跨膜区包括选自CD4，CD8α，CD28和CD3ζ中的至少之一或其片段。
[0024]根据本专利技术的实施例，所述跨膜区包括CD8跨膜区或其片段。
[0025]根据本专利技术的实施例，所述跨膜区具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
[0026]根据本专利技术的实施例，所述免疫共刺激分子包括选自CD28、ICOS、4
‑
1BB、OX40和CD27中的至少之一。
[0027]根据本专利技术的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段是4
‑
1BB或CD28的胞内段或其
片段。
[0028]根据本专利技术的实施例，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转基因免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达嵌合抗原受体以及免疫刺激分子，所述免疫刺激分子包括IL
‑
15。2.根据权利要求1所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区能够与抗原特异性结合；跨膜区；以及胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段和信号转导结构域；其中，所述胞外区的C端与所述跨膜区的N端相连，所述跨膜区的C端与所述胞内区的N端相连。3.根据权利要求2所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述抗原是肿瘤相关抗原。4.根据权利要求2所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述胞外区包括抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体结合所述抗原。5.根据权利要求2所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述抗体为单链抗体。6.根据权利要求2所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述抗原包括选自间皮素、HER2、EGFR、GPC3、MUC1、CEA、CLDN 18.2、EpCAM、GD2、PSCA、CD133、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA中的至少之一；优选地，所述抗原为间皮素；任选地，所述胞外区包括抗间皮素单链抗体；任选地，所述抗间皮素单链抗体包括抗间皮素抗体的轻链可变区、连接肽1以及抗间皮素抗体的重链可变区；任选地，所述连接肽1具有(GGGGS)n所示的氨基酸序列，其中n为大于或等于1的整数，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；任选地，抗间皮素单链抗体包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。7.根据权利要求6所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述胞外区进一步包括铰链区片段，所述铰链区片段的N端与所述单链抗体的C端相连；任选地，所述铰链区片段包括选自CD8、CD28和免疫球蛋白的铰链区中的至少之一；任选地，所述铰链片段包括CD8的铰链区；任选地，所述铰链片段包括SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。8.根据权利要求2所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述跨膜区包括选自CD4、CD8α、CD28和CD3ζ中的至少之一或其片段；任选地，所述跨膜区包括CD8跨膜区或其片段；任选地，所述跨膜区具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。9.根据权利要求2所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述免疫共刺激分子包括选自CD28、ICOS、4
‑
1BB、OX40和CD27中的至少之一；任选地，所述免疫共刺激分子胞内段是4
‑
1BB或CD28的胞内段或其片段；任选地，所述免疫共刺激分子胞内段包括SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。10.根据权利要求2所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述免疫共刺激分子胞内段的C端与所述信号转导结构域的N端相连；任选地，所述信号转导结构域包括选自CD3ζ或FcεRIγ中的至少之一或其片段；任选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ或其片段；
任选地，所述信号转导结构域包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。11.根据权利要求1所述的转基因免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞包括T细胞和NK细胞中的至少之一，优选为NK细胞；任选地，所述NK细胞包括选自外周血NK细胞、脐带血NK细胞、诱导多能细胞(iPSC)衍生NK细胞和NK
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92细胞中的至少之一；任选地，所述T细胞包括CD4
+
T细胞、CD8
+
T细胞和γδT细胞。12.一种分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子编码免疫刺激分子，所述免疫刺激分子包括IL
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15。13.根据权利要求12所述的分离的核酸，其特征在于，所述嵌合抗原受体是如权利要求2～10任一项中所定义的。14.根据权利要求12所述的分离的核酸，其特征在于，所述第一核酸分子以及所述第二核酸分子被设置在免疫细胞中表达所述嵌合抗原受体和所述免疫刺激分子，并且所述免疫刺激分子与所述嵌合抗原受体呈非融合形式。15.根据权利要求12所述的分离的核酸，其特征在于，进一步包括：内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。16.根据权利要求12所述的分离的核酸，其特征在于，进一步包括：第三核酸分子，设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码连接肽2，所述连接肽2能够在所述免疫细胞中被切割；任选地，所述连接肽2包括2A肽或其片段；任选地，所述连接肽2包括P2A、T2A、E2A和F2A中的至少之一或其片段；任选地，所述连接肽2包括P2A或其片段；任选地，所述连接肽2包括SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。17.根据权利要求12所述的分离的核酸，其特征在于，进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。18.根据权利要求12所述的分离的核酸，其特征在于，所述第一启动子、所述第二启动子分别独立地选自U6、H1、CMV、EF
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1、LTR或RSV启动子。19.根据权利要求12所述的分离的核酸，其特征在于，进一步包括：第四核酸分子，所述第四核酸分子编码信号肽；任选地，所述第四核酸分子与所述第一核酸分子可操作性地相连；任选地，所述信号肽包括选自CSF2R和CD8α中的至少之一或其片段；任选地，所述信号肽包括CSF2R或其片段；任选地，所述信号肽包括SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。20.根据权利要求12～19任一项所述的分离的核酸，其特征在于，所述第一核酸分子具有SEQ IDNO:3、4、5、6和7所示的核苷酸序列中的至少之一；任选地，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；任选地，所述第三核酸分子具有SEQ ID NO:8所示的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彩，胡渊，陈敏华，王烃，伏永玲，
申请(专利权)人：上海恩凯细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：