低成瘤性的MDCK细胞株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供低成瘤性MDCK细胞株及其构建方法和应用。本发明专利技术自噬相关基因敲除的MDCK细胞株通过CRISPR Cas9基因编辑系统敲除lc3基因或者sqstm1基因，整体上获得了低成瘤性的细胞株，应用安全性更高。应用安全性更高。应用安全性更高。

【技术实现步骤摘要】
低成瘤性的MDCK细胞株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞应用
，具体涉及低成瘤性MDCK细胞株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]成瘤性是指基质细胞在动物体内形成肿瘤的特性。《中国药典》规定新建细胞系/株及新型细胞基质应进行成瘤性检查。因此用于疫苗生产的细胞系都应进行成瘤性检查，而对已经进行过成瘤性检查的细胞，若其进行过基因方面的改造，则也同样应该检查成瘤性。目前，已证明具有成瘤性的常用细胞有CHO、BHK21、MDCK等细胞。
[0003]其中，MDCK细胞是正常犬肾来源的传代细胞，其是由Madin和Darby从考克斯班尼犬的肾脏组织中分离培养获得，此类肾脏细胞在原代培养时形态类似成纤维细胞。目前，MDCK细胞常用于病毒的扩增、纯化和检测，被认为是最适用于病毒疫苗生产的细胞系之一，因此有必要探究构建具有低成瘤性的MDCK细胞株。

技术实现思路

[0004]基于此，有必要提供低成瘤性MDCK细胞株及其构建方法和应用，通过基因编辑敲除MDCK细胞株中的自噬相关基因获得低成瘤性的细胞株，应用安全性更好。
[0005]本专利技术采用如下技术方案：
[0006]本专利技术提供一种低成瘤性MDCK细胞株，所述MDCK细胞株的自噬相关基因被敲除。
[0007]所述低成瘤性MDCK细胞株为MDCK
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lc3KO细胞株，于2022年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉大学，请求保藏的培养物培养物分类命名为：基因缺失的犬肾细胞MDCK
‑
lc3KO，保藏编号为CCTCC NO:C2022288。
[0008]所述低成瘤性MDCK细胞株为MDCK
‑
sqstm1KO细胞株，于2022年9月9日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：武汉大学，请求保藏的培养物分类命名为：基因缺失的犬肾细胞MDCK
‑
sqstm1KO，保藏编号为CCTCC NO:C2022289。
[0009]本专利技术还提供低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，包括如下步骤：采用CRISPR Cas9基因编辑系统来敲除MDCK细胞中的自噬相关基因；验证自噬相关基因敲除的MDCK细胞株的成瘤性。
[0010]在其中一些实施例中，所述自噬相关基因为lc3基因，针对lc3基因靶点序列为：GCCGGTCCGAGGGCATCGCG。基于CRISPR Cas9基因编辑系统来敲除lc3基因的gRNA序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。针对lc3基因敲除所构建的载体采用的5
’
同源臂和3
’
同源臂的序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
[0011]在其中一些实施例中，所述自噬相关基因为sqstm1基因，针对sqstm1基因靶点序列为：CCATGCGCTCAGGAGGCACC。基于CRISPR Cas9基因编辑系统来敲除sqstm1基因的gRNA序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示。针对sqstm1基因敲除所构建的载体采用的5
’
同源臂和3
’
同源臂的序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。
[0012]上述低成瘤性MDCK细胞株可以在培养病毒、制备病毒疫苗中进行应用。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0014]本专利技术采用CRISPR
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Cas9基因编辑方法，成功得到了自噬相关基因敲除的MDCK
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lc3
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KO和MDCK
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sqstm1
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KO细胞株，并且经验证MDCK
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lc3
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KO和MDCK
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sqstm1
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KO细胞株的成瘤性较原始MDCK细胞显著降低，应用更安全。
附图说明
[0015]图1为pX330以及pY75质粒图谱(a：pX330，b：pY75)。
[0016]图2为lc3
‑
KO5'同源臂连接及菌液PCR核酸电泳。
[0017]图3为lc3
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KO 3'同源臂连接及菌液PCR核酸电泳。
[0018]图4为MDCK细胞和MDCK
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lc3 KO细胞Q
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PCR结果。
[0019]图5为sqstm1
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KO5'同源臂连接及菌液PCR核酸电泳。
[0020]图6为sqstm1
‑
KO3'同源臂连接及菌液PCR核酸电泳。
[0021]图7为MDCK细胞和MDCK
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sqstm1 KO细胞Q
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PCR实验结果。
[0022]图8为MDCK
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lc3 KO和MDCK
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sqstm1KO基因组定位PCR验证。
[0023]图9为三种细胞的生长曲线对比图。
[0024]图10为MDCK细胞和MDCK
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lc3 KO细胞在lc3上表达差异对比。
[0025]图11为MDCK细胞和MDCK
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sqstm1KO细胞在sqstm1上表达差异对比。
[0026]图12为三种细胞平板克隆形成实验镜下及结晶紫染色对比。
[0027]图13为三种细胞平板克隆平均克隆数统计对比。
[0028]图14为三种细胞的软琼脂克隆形成实验第10天克隆形成镜下图。
[0029]图15为三种细胞软琼脂克隆平均克隆数对比。
[0030]图16为三种细胞107/只接种裸鼠4月后平均瘤体面积体重比。
[0031]图17为裸鼠接种细胞后4个月重要器官组织病理切片结果(20X)。
[0032]图18为裸鼠接种细胞后4个月主要免疫相关器官组织以及瘤体的病理切片结果(20X)。
[0033]上述部分图中统计差异的显示：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns无显著差异。
具体实施方式
[0034]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。以下各实施例，仅用于说明本专利技术，但不止用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。在本专利技术实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本专利技术实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0035]本专利技术的技术构思在于采用CRISPR
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Cas9基因编辑方法敲除MDCK细胞中的自噬相关基因，获得成瘤性更低本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低成瘤性MDCK细胞株，其特征在于，所述MDCK细胞株的自噬相关基因被敲除。2.根据权利要求1所述的低成瘤性MDCK细胞株，其特征在于，所述低成瘤性MDCK细胞株为MDCK
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lc3KO细胞株，保藏编号为C2022288；或者所述低成瘤性MDCK细胞株为MDCK
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sqstm1KO细胞株，保藏编号为C2022289。3.一种权利要求1所述的低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：采用CRISPR Cas9基因编辑系统来敲除MDCK细胞中的自噬相关基因；验证自噬相关基因敲除的MDCK细胞株的成瘤性。4.根据权利要求3所述的低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，所述自噬相关基因为lc3基因，针对lc3基因靶点序列为：GCCGGTCCGAGGGCATCGCG。5.根据权利要求4所述的低成瘤性MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，基于CRISPR Cas9基因编辑系统来敲除lc3基因的gRNA序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓明，张家友，龚铮，张哲罡，乐洋，年悬悬，郑嘉昊，刘博，王泽鋆，李新国，段凯，
申请(专利权)人：武汉生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：