一种增强向肿瘤部位浸润能力的CAR-NK细胞制备及应用制造技术

本发明专利技术提出一种转基因细胞及其应用，所述转基因细胞表达嵌合抗原受体以及趋化因子受体，所述趋化因子受体包括CXCR2和CXCR6。所述转基因细胞能够同时表达和分泌嵌合抗原受体和趋化因子受体，使得转基因细胞能够靶向肿瘤抗原，提高CAR

【技术实现步骤摘要】
一种增强向肿瘤部位浸润能力的CAR
‑
NK细胞制备及应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体地，本专利技术涉及一种CAR
‑
NK细胞的制备及其在肿瘤治疗中的用途，更具体地，本专利技术涉及一种增加CAR
‑
NK细胞向肿瘤部位浸润能力的构建体、表达载体、转基因细胞、药物组合物及其用途。

技术介绍

[0002]近年来，嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T，CAR
‑
T)细胞在血液恶性肿瘤治疗中取得了令人瞩目的效果。但是CAR
‑
T细胞在临床应用中易产生细胞因子风暴、神经毒性、移植物抗宿主病(GVHD)等不良反应。另外，目前CAR
‑
T细胞对实体瘤的治疗效果尚不理想，使得CAR
‑
T细胞的临床应用仍面临挑战。CAR
‑
NK细胞较CAR
‑
T细胞具有安全性好的优势，一般不会引起细胞因子风暴和GVHD等副作用；NK细胞不需要抗原递呈、不受MHC限制，即可发挥直接的杀伤肿瘤细胞的作用；CAR
‑
NK细胞可以以CAR依赖和NKR依赖等多种识别机制识别和杀伤肿瘤，抗瘤谱广。因此，CAR
‑
NK细胞在抗肿瘤治疗中具有广泛的应用前景，已成为细胞免疫治疗研发领域的热点。然而，CAR
‑
NK细胞治疗实体瘤面临的难题之一是NK细胞难以浸润到实体瘤内部，影响实体瘤患者NK细胞输注临床结果的重要制约因素是未能有足量的NK细胞迁移至肿瘤部位发挥杀瘤作用，将NK细胞有效运输到肿瘤部位是癌症免疫治疗成功的关键。因此，提高NK细胞向实体瘤内部浸润的能力成为基因修饰NK细胞的重要研发策略。
[0003]趋化因子和趋化因子受体在T或NK细胞等淋巴细胞向肿瘤迁移过程中起着重要作用。淋巴细胞可以通过细胞表面的趋化因子受体被肿瘤分泌的趋化因子吸引招募而被引导进入肿瘤部位。CXCR2为多种趋化因子(CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL7和CXCL8)的受体。这些趋化因子在肝癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、胰腺癌、卵巢癌等多种实体瘤高表达，且与肿瘤增殖、血管生成、侵袭转移及免疫抑制微环境的形成有关。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0005]专利技术人发现，CXCR2通常只表达于记忆B细胞和某些髓系细胞(如中性粒细胞和嗜碱性粒细胞)，人T细胞和NK细胞均不表达，因此，T细胞和NK细胞难以浸润至肿瘤部位的原因。因此，如果在淋巴细胞中过表达CXCR2有望有效促进T细胞或NK细胞向肿瘤部位的聚集，有效提高T细胞或NK细胞的抗肿瘤效果。且专利技术人发现，当在CAR
‑
淋巴细胞共表达CXCR2受体时，相比于共表达CXCR6受体，其向肿瘤的趋化和靶向能力更强，对肿瘤细胞的杀伤能力更强。
[0006]为此，本专利技术提出了一种CAR
‑
淋巴细胞，其表面单链抗体可以识别所有实体瘤和血液瘤的肿瘤抗原并且可以在胞内表达CXCR2受体，增强淋巴细胞向肿瘤部位的迁移能力，有效提高淋巴细胞对于肿瘤的杀伤效果。
[0007]因此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种构建体。根据本专利技术的实施例，所
述构建体包括第一核酸以及第二核酸。其中，第一核酸编码嵌合抗原受体，第二核酸编码趋化因子受体。
[0008]根据本专利技术实施例，所述构建体能够同时编码嵌合抗原受体和趋化因子受体。将本专利技术实施例的构建体导入淋巴细胞，在淋巴细胞表面表达嵌合抗原受体和趋化因子受体。其中，所述嵌合抗原受体能够使得淋巴细胞靶向肿瘤抗原，定位至表达所述抗原的细胞表面。此外，所述趋化因子受体能够增加淋巴细胞向肿瘤部位的浸润能力，有效提高淋巴细胞的杀伤肿瘤效果。
[0009]根据本专利技术的实施例，上述构建体还可以包括下列附加技术特征中的至少之一：
[0010]根据本专利技术的实施例，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体和CD8铰链区，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述胞外区单链抗体可以特异性识别肿瘤抗原，所述单链抗体的C端与所述CD8铰链区的N端相连。
[0011]跨膜区，所述跨膜区包括CD8跨膜区，所述CD8跨膜区的N端与所述胞外区的CD8铰链区的C端相连，并且嵌入到所述细胞细胞膜中；
[0012]胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连，所述胞内区包括4
‑
1BB共刺激因子结构域和CD3ζ胞内信号段。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述肿瘤抗原选自胚胎性蛋白、糖蛋白抗原、鳞状细胞抗原等，包括MSLN(间皮素)、HER2、EGFR、GPC3、MUC1、CEA、CLDN 18.2、EpCAM、PSCA、GD2、IL
‑
13RA2、B7
‑
H3、CD133、ROR1、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA的至少之一。
[0014]根据本专利技术的实施例，所述趋化因子受体包括选自CXCR2、CXCR6中的至少之一。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述趋化因子为CXCR2。CXCR2的表达使得淋巴细胞向肿瘤内部的浸润能力更强。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述单链抗体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述CD8跨膜区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；所述4
‑
1BB共刺激因子结构域具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；所述CD3ζ胞内信号段具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述CD8铰链区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述CXCR2具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述CXCR6具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。
[0017]DIQMAQVQLVQSGAEVKRPGASVQVSCRASGYSINTYYMQWVRQAPGAGLEWMGVINPSGVTSYAQKFQGRVTLTNDTSTNTVYMQLNSLTSADTAVYYCARWALWGDFGMDVWGKGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASIGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGAPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPLTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO.1)
[0018]IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO.2)
[0019]KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO.3)
[0020]RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建体，其特征在于，包括：第一核酸，所述第一核酸编码嵌合抗原受体；以及第二核酸，所述第二核酸编码趋化因子受体。2.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体和CD8铰链区，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述胞外区单链抗体可以特异性识别肿瘤抗原，所述单链抗体的C端与所述CD8铰链区的N端相连；跨膜区，所述跨膜区包括CD8跨膜区，所述CD8跨膜区的N端与所述胞外区的CD8铰链区的C端相连；胞内区，所述胞内区的N端与所述跨膜区的C端相连，所述胞内区包括4
‑
1BB共刺激因子结构域和CD3ζ胞内信号段。3.根据权利要求2所述的构建体，其特征在于，所述肿瘤抗原选自：胚胎性蛋白、糖蛋白抗原、鳞状细胞抗原等，包括MSLN、HER2、EGFR、GPC3、MUC1、CEA、CLDN 18.2、EpCAM、PSCA、GD2、IL
‑
13RA2、B7
‑
H3、CD133、ROR1、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、BCMA中的至少之一。4.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述趋化因子受体包括选自CXCR2、CXCR6中的至少之一，优选地，所述趋化因子为CXCR2。5.根据权利要求2或权利要求4任一项所述的构建体，其特征在于，所述单链抗体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；所述CD8跨膜区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；所述4
‑
1BB共刺激因子结构域具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；所述CD3ζ胞内信号段具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述CD8铰链区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述CXCR2具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；所述CXCR6具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列。6.根据权利要求1所述的构建体，其特征在于，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置为转基因细胞中表达所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体，并且所述嵌合抗原受体以及所述趋化因子受体呈非融合形式。7.根据权利要求6所述的构建体，其特征在于，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子设置于同一载体上。8.根据权利要求6所述构建体，其特征在于，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子设置于不同的载体上。9.根据权利要求7所述的构建体，其特征在于，所述构建体进一步包括：内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。10.根据权利要求7所述的构建体，其特征在于，所述构建体进一步包括：第三核酸分子，设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码自剪切肽P2A，所述自剪切肽P2A能够在所述转基因细胞中被切割。11.根据权利要求10所述的构建体，其特征在于，所述自剪切肽P2A具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求7或8所述的构建体，其特征在于，进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及第二启动子，所述第二启动子与所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彩，胡渊，陈敏华，王烃，谢思奇，伏永玲，
申请(专利权)人：上海恩凯细胞技术有限公司，
类型：发明
国别省市：